【摘要】：慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)是多種原因造成的慢性進(jìn)行性腎實(shí)質(zhì)損傷,腎纖維化是整個(gè)腎臟損傷過(guò)程的主要病理特征和根本病理改變。在CKD的臨床治療上,藥用大黃已凸顯出獨(dú)特的作用,但其主要的活性部位及各部位抗腎纖維化的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。代謝組學(xué)在疾病的臨床診斷、病理機(jī)制探究、生物標(biāo)示物鑒定及藥物作用機(jī)制研究中有不可或缺的作用。因此,本研究欲結(jié)合藥理學(xué)及代謝組學(xué)的研究方法,從分子生物學(xué)與生物化學(xué)角度共同闡釋中藥大黃治療CKD的主要活性部位及其抗腎纖維化的作用機(jī)制。研究方法:將40只體重為200±10 g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(CTL)、CKD組和大黃石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)提取物給藥組。后四組大鼠灌服200 mg/kg·d~(-1)的腺嘌呤(含1%體積的阿拉伯膠),CTL組灌服等體積的生理鹽水。大黃PE、EA和BU提取物組大鼠給予腺嘌呤3 h后再分別灌服劑量為800 mg/kg·d~(-1)的PE提取物、200 mg/kg·d~(-1)的EA提取物和600 mg/kg·d~(-1)的BU提取物。分別于第3和6周末,收集各組大鼠尿液;于第6周末,取頸動(dòng)脈血和腎組織。血清和尿液用于生化指標(biāo)檢測(cè)、代謝組學(xué)與脂質(zhì)組學(xué)研究;腎組織用于代謝組學(xué)、病理學(xué)、免疫組織化學(xué)及蛋白印跡研究。研究結(jié)果:(1)生化指標(biāo)檢測(cè):相比CTL組,CKD組血清中肌酐、尿素、甘油三酯、膽固醇、尿酸等含量顯著增加。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,肌酐、尿素、甘油三酯、膽固醇和白細(xì)胞的含量顯著地減少,肌酐清除率、紅細(xì)胞和血球密度的含量顯著地增加,表明大黃各提取物對(duì)腎功能均有顯著的改善作用。(2)病理學(xué)研究:蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和糖原染色(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色結(jié)果顯示CKD組腎組織中腎小管管腔擴(kuò)張和炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加;Masson染色結(jié)果顯示CKD組大鼠腎組織顯示不同程度的纖維化。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,腎小管管腔擴(kuò)張和腎間質(zhì)纖維化明顯減輕,炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少。其中,大黃EA提取物給藥組的效果最佳,BU提取物的效果次之。(3)免疫組織化學(xué)分析:相比CTL組,CKD組中α-SMA、Collagen I、Fibronectin和TGF-β/Smad信號(hào)通路中p-Smad2,Smad2,p-Smad3,Smad3與Smad4的表達(dá)顯著的升高,而Smad7的表達(dá)顯著的降低。大黃各提取物顯著抑制這些蛋白的異常表達(dá);其中,大黃EA及BU提取物的抑制效果最佳。(4)蛋白印跡分析:相比CTL組,CKD組中TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin、FSP1的表達(dá)顯著地增加,E-cadherin的表達(dá)顯著地減少。大黃PE、EA和BU提取物給藥后可逆轉(zhuǎn)E-cadherin的下調(diào),顯著降低TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin和FSP1的表達(dá)。(5)尿液代謝組學(xué)研究結(jié)果:從大鼠尿液中鑒定28個(gè)生物標(biāo)示物,代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物與氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代謝密切有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,N-乙酰半胱氨酸、(2S)-2-[[9-[(2S,3R,4S,5R)-3,4-二羥基-5-(羥基甲基)四氫呋喃-2-基]嘌呤-6-基]氨基]丁二酸、肌酐、脫氧腺苷、組胺、羥基丙酮酸和甲基胞嘧啶的含量顯著地增加,色氨酸、甲基N-3-丁烯酰甘氨酸酯、3-甲基二氧基吲哚、吡哆醇、嘧啶和三甲胺的含量顯著地降低。該結(jié)果表明大黃各提取物可顯著地改善異常的氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代謝,從而進(jìn)一步延緩腎纖維化。(6)血清代謝組學(xué)及血漿脂質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果:24個(gè)生物標(biāo)示物進(jìn)行鑒定分析發(fā)現(xiàn)14個(gè)生物標(biāo)示物源于血清代謝組學(xué)研究的結(jié)果,10個(gè)生物標(biāo)示物源于脂質(zhì)組學(xué)研究的結(jié)果。代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)24個(gè)生物標(biāo)示物與脂肪酸、煙酸、嘧啶和花生二烯酸代謝有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,5,6-丙酸乙酯、葡糖腦苷脂、甘油三酯(55:1)、D-葡萄糖和哌啶甲酸的含量顯著地增加;甘油三酯(53:0)、甘油二酯(38:9)、神經(jīng)酰三己糖苷、棕櫚酸、組氨酸-谷氨酰胺和煙酰胺的含量顯著減少,表明大黃各提取物對(duì)異常的脂肪酸代謝、煙酸、嘧啶和花生二烯酸代謝有明顯的改善作用。(7)腎組織代謝組學(xué)研究結(jié)果:腎組織代謝組學(xué)研究鑒得21個(gè)生物標(biāo)示物,代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)示物與氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循環(huán)和煙酸代謝有關(guān)。大黃PE、EA和BU提取物給藥后,微球蛋白(18:3)、溶血磷脂酰膽堿(18:1)、硬脂酸、棕櫚酸和亞麻酸的含量顯著地減少,十六烯二酸和犬尿酸的含量顯著地增加。其中,EA提取物給藥組亞�；撬岬暮匡@著地減少。BU提取物給藥組3-羥基丁酸、2-甲基呋喃、尿嘧啶和PE提取物給藥組苯基丙酮酸及煙酰胺的含量顯著地增加,十八碳烯酸和棕櫚酸的含量顯著地減少。該結(jié)果表明大黃各提取物對(duì)異常代謝的氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循環(huán)、煙酸代謝有很強(qiáng)的改善作用。結(jié)論:藥理學(xué)及代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃PE、EA和BU提取物是大黃治療CKD的活性部位,三個(gè)活性部位均有改善腎功能和抗腎纖維化的作用。其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路和改善氨基酸、肌酐、嘌呤、嘧啶、脂質(zhì)與煙酸等在內(nèi)的多種異常代謝有關(guān)。
【圖文】：

用于蛋白印跡分析和灰度測(cè)定。2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1 大黃治療 CKD 的 HE 染色結(jié)果如圖 5 所示，，CKD 組腎小管管腔擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加；相比 CKD 組，CKD+PE提取物給藥組腎小管管腔擴(kuò)張減輕，但炎細(xì)胞浸潤(rùn)未見減少；CKD+EA 提取物給藥組炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，腎小管管腔擴(kuò)張顯著減輕；CKD+BU 提取物給藥組，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，腎小管管腔擴(kuò)張減輕。

圖 6 CTL 組、CKD 組及各給藥組大鼠腎臟組織 Masson 染色分析（ 200）附注 2：**表示 CKD 組與 CTL 組比較 P < 0.01；#表示大黃提取物給藥組與 CKD 組比較 P < 0.05，##表示大黃提取物給藥組與 CKD 組比較 P < 0.01。2.4.3 大黃治療 CKD 的 PAS 染色分析結(jié)果結(jié)果如圖 7 所示，相比 CTL 組，CKD 組腎小管管腔顯著擴(kuò)張；大黃提取物給藥后，腎小管管腔擴(kuò)張均減輕。其中，大黃 EA 提取物給藥組腎小管管腔擴(kuò)張顯著減輕，大黃BU 和 PE 提取物給藥組的效果次之。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2630316