發(fā)布時間：2020-04-15 16:50

【摘要】：百藥煎是由五倍子、茶葉和酒糟等原料經(jīng)自然發(fā)酵制備而成的傳統(tǒng)中藥飲片,具有潤肺化痰、解熱生津等功效,主治肺虛久咳、便血痔血、皮膚濕爛等癥。五倍子為百藥煎的主要原料,含有大量鞣質(zhì)類成分。據(jù)報道,百藥煎中五倍子鞣質(zhì)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生成藥效物質(zhì)沒食子酸。沒食子酸具有抗菌、抗病毒、降糖降脂等藥理活性。百藥煎傳統(tǒng)炮制是利用自然界存在多種微生物的混合固體發(fā)酵完成,存在發(fā)酵菌種不穩(wěn)定、混雜有無效菌株,可能造成百藥煎發(fā)酵基質(zhì)中沒食子酸濃度波動性較大,影響百藥煎的質(zhì)量穩(wěn)定。因此,分離鑒定百藥煎傳統(tǒng)炮制過程中關(guān)鍵微生物菌群及篩選可用于百藥煎現(xiàn)代發(fā)酵的菌種,有助于實現(xiàn)百藥煎的現(xiàn)代穩(wěn)定菌種組合的混合固體發(fā)酵工藝。本文采用經(jīng)典的微生物分離與分類方法,從百藥煎傳統(tǒng)炮制過程樣品中分離獲得其中微生物菌群,并結(jié)合菌種形態(tài)特征(菌落形態(tài)、顯微形態(tài))、部分生理生化特性和16SrRNA/18SrRNA分子生物學(xué)特性,對其進行初步的分類鑒定。進一步考察了菌種的抑菌活性、產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力及其鞣質(zhì)轉(zhuǎn)化特性;以具有降解鞣質(zhì)能力的微生物為出發(fā)菌種,開展單菌發(fā)酵和混菌液體發(fā)酵,篩選出單菌鞣質(zhì)降解能力較強菌株及具有協(xié)同增強鞣質(zhì)降解生成沒食子酸能力的最佳混菌組合。固態(tài)發(fā)酵進一步驗證篩選得到的最佳混菌組合,并初步優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵工藝。主要研究結(jié)果如下:通過剔除類同菌種后,從百藥煎傳統(tǒng)炮制過程的樣品中共分離純化獲得17種菌,并初步鑒定為:7種細菌(地衣形芽孢桿、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、芽孢桿菌屬菌、巨大芽孢桿菌菌株、同溫層芽孢桿菌、芽孢桿菌屬菌)、7種酵母菌(伯頓絲孢畢赤酵母、克魯維酵母菌、克魯維酵母菌、弗比恩酵母菌、奧默柯達菌、異常威克漢姆酵母菌、異常畢赤酵母菌)、3種絲狀真菌(青霉菌屬真菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌屬真菌)。百藥煎樣品中暫未分離得到致病菌。通過抑菌活性分析,發(fā)現(xiàn)菌種HMB3、HMB4、HMB7和HMY3代謝產(chǎn)物具有抑制金黃色葡萄球菌的活性,其中菌種HMB3和HMB7的代謝產(chǎn)物還具有抑制大腸桿菌的活性。所有細菌均具有產(chǎn)胞外蛋白酶能力,其余菌株均無此能力;所有菌株均無產(chǎn)胞外淀粉酶能力。通過平板初篩得到13種具鞣質(zhì)降解特性的菌種,包括5種細菌(HMB1、HMB2、HMB3、HMB5、HMB6);5 種酵母菌(HMY1、HMY2、HMY5、HMY6、HMY7);3 種絲狀真菌(HMF1、HMF2、HMF3)。對具有鞣質(zhì)降解能力的菌種進行單菌發(fā)酵和混菌液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),以HPLC方法檢測發(fā)酵液中沒食子酸的含量,篩選獲得具協(xié)同降解鞣質(zhì)生成沒食子酸能力的最佳混菌組合為HMB2、HMB5、HMY1、HMY2的四菌組合。最佳混菌組合固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化后:在底物濃度為50%、接種量為1.2ml,細菌和酵母菌的接種比例為1:2,30℃條件下培養(yǎng)66h,百藥煎中沒食子酸含量約為0.59g/g樣品,而百藥煎傳統(tǒng)炮制品中沒食子酸為0.52 g/g百藥煎,增加了約11%,且最佳混菌固態(tài)發(fā)酵后樣品對金黃色葡萄球菌的抑制活性均優(yōu)于百藥煎炮制品。本研究獲得最佳混菌組合為實現(xiàn)百藥煎的現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)奠定了菌種基礎(chǔ),也降低了百藥煎飲片發(fā)酵過程中真菌毒素污染的可能性。
【圖文】：

２．３．２．１細菌的分離逡逑在ＬＢ培養(yǎng)基中添加可抑制真菌生長的制霉菌素用以分離樣品中的細菌，分逡逑離得到的部分細菌菌落形態(tài)見圖２－１。逡逑：逡逑圖２－１百藥煎樣品中細菌分離結(jié)果（１？４分別為樣品Ｃｌ？Ｃ４的稀釋液細菌分離結(jié)果，５和６逡逑分別為樣品Ｃ７和Ｃ８稀釋液的細菌分離結(jié)果）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｇａｌｌ邋ｌｅａｖｅｎ邋（１？４：邋ｔｈｅ逡逑ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｄｉｌｕｔｅｄ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ１－Ｃ４，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋５，邋６：逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋Ｃ７邋ａｎｄ邋Ｃ８邋ｄｉｌｕｅｎｔｓ，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）．逡逑由圖２－１可見，上述培養(yǎng)基中總共出現(xiàn)了邋７yL不同的細菌，第１種菌落圓形，逡逑灰白色，，輕微凸起、邊緣無規(guī)則、濕潤；第２種淡黃白色、扁平、表面濕潤、周逡逑圍有透明圈；第３種菌落黃白色、表面無規(guī)則干燥褶皺，、生長早期有小水珠；逡逑第４種菌落暗黃色、濕潤

Ｃｌ邋Ｃ２邋Ｃ３邋Ｃ４邋Ｃ５邋Ｃ６邋Ｃ７邋Ｃ８逡逑樣品編號逡逑圖２－２百藥煎炮制過程中細菌的菌數(shù)變化規(guī)律逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｒｕｌｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｕｎｔｓ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｏｆ邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｇａｌｌ邋ｌｅａｖｅｎ逡逑由圖２－２可見，在百藥煎炮制過程種菌株ＨＭＢｌ、ＨＭＢ３和ＨＭＢ７菌數(shù)變化逡逑規(guī)律相同、在樣品Ｃ１￣Ｃ５中菌數(shù)均無明顯變化，在樣品Ｃ６中菌數(shù)開始增加，并逡逑在樣品Ｃ７和Ｃ８中菌數(shù)急劇增多。逡逑２．３．３真菌的分離與純化逡逑在ＰＤＡ培養(yǎng)基中添加可抑制細菌生長的硫酸鏈霉素用以分離樣品中的真菌，逡逑分離得到的部分真菌菌落形態(tài)見圖２－３。逡逑曑匪逡逑圖２－３百藥煎樣品的上真菌分離計數(shù)結(jié)果圖（ａ？ｄ分別為樣品Ｃ１？Ｃ４稀釋液中真菌分離結(jié)逡逑果；ｅ為樣品Ｃ８稀釋液的真菌分離結(jié)果）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｆｒｏｍ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ邐NB“／／邋／ｅｍｍ邋（ａ￣ｄ：邋ｔｈｅ邋ｆｕｎｇｉ逡逑ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕＵｓ邋ｏｆ邋１０邋ｔｉｍｅｓ邋ｄｉｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ１邋？Ｃ４，邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；邋ｅ：邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｉ邋ｉｓｏｌａｔｂ＾＾逡逑ｏｆ邋１０邋ｔｉｍｅｓ邋ｄｉｌｕｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｅ邋Ｃ８）逡逑１３逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R283

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本文編號：2628766