發(fā)布時間：2020-04-14 20:17

【摘要】：目的:本專題以黃芩射干湯為研究對象,在文獻研究和前期血清藥物化學研究的基礎上,篩選出黃芩射干湯有效成分群;利用分子對接技術,預測活性成分與相關靶點的作用方式及強弱,模擬黃芩射干湯可能的作用機制;建立大鼠感染后咳嗽模型,檢測相關指標,從蛋白表達、體內(nèi)生物標記物變化方面驗證分子對接結(jié)果,探討其作用機制;采用HPLC法,對黃芩射干湯篩選出的活性成分進行質(zhì)量控制研究,上述研究將為黃芩射干湯臨床應用奠定基礎。材料與方法:1.通過查閱相關國內(nèi)外文獻以及TCMSP數(shù)據(jù)庫,篩選了16個已報道的藥理活性明確的黃酮類化合物,歸納總結(jié)了10個與氣道炎癥通路相關的蛋白結(jié)構,從PDB網(wǎng)站中查找蛋白-配體復合物晶體結(jié)構,采用Autodock 4.02對接軟件對化合物與蛋白進行分子對接研究,通過相對分值(R=化合物的結(jié)合自由能/共結(jié)晶的結(jié)合自由能)評估各蛋白與化合物的作用強弱,選擇作用較強的蛋白進行后續(xù)驗證實驗。2.根據(jù)分子對接的R值結(jié)論,進行動物體內(nèi)驗證實驗。基于大鼠感染后咳嗽模型,采用HE染色法,觀察模型動物肺組織氣管、支氣管、肺泡的形態(tài),采用Western-blot方法檢測動物肺組織中相關蛋白的表達水平,采用ELISA法檢測大鼠血清、肺泡灌洗液細胞因子的水平。3.應用HPLC-VWD法,對黃芩射干湯中篩選的黃芩苷等8個活性成分進行含量測定研究,為黃芩射干湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。結(jié)果:1.通過分子對接技術,利用相關數(shù)據(jù)庫及分子對接軟件,總結(jié)了黃芩射干湯所含16個黃酮類化合物的分子量、氫鍵給體、氫鍵受體及脂水分配系數(shù),結(jié)果表明黃芩射干湯黃酮類化合物符合“Lipinski”類藥性規(guī)則,表明黃芩射干湯黃酮具有良好的類藥性。從分子對接能量相對分值結(jié)果來看,黃芩射干湯黃酮類成分與炎癥代謝通路靶點中的COX-2及5-LOX的結(jié)合較好,R值均大于0.8,與P38 MAPK、PLA_2、JNK 3及CYP4502C9亞型分子對接的相對分值也較好,R值均大于0.7,個別成分與JNK 1、LTA_4H、CYP450 2C8及IKK-β分子對接的相對分值稍差,但都大于0.6;從化合物與蛋白的作用方式看,16個黃酮類成分均能與10個蛋白結(jié)合,表明黃芩射干湯所含黃酮類成分可能通過多成分、多途徑、多靶點發(fā)揮抗氣道炎癥作用,其作用途徑可能與AA代謝網(wǎng)絡中COX-2及5-LOX關系密切。2.基于分子對接實驗結(jié)果,選擇LPS感染大鼠咳嗽動物模型作為藥物初步作用模式研究的模型。動物模型組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著增加,給予藥物黃芩射干湯后能抑制模型大鼠5 min內(nèi)咳嗽次數(shù),減輕肺組織中支氣管和周圍炎癥。采用Western-blot法檢測模型動物大鼠肺組織中COX-2和5-LOX蛋白表達水平,結(jié)果表明:與正常對照組比較,模型組COX-2、5-LOX蛋白表達水平顯著升高(P0.05),說明所建立LPS感染大鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代謝通路中的COX-2和5-LOX,給予黃芩射干湯藥物后,COX-2蛋白表達水平顯著降低(P0.05),而5-LOX蛋白表達無顯著作用(P0.05),提示黃芩射干湯可能通過抑制花生四烯酸COX-2代謝途徑從而發(fā)揮作用;采用ELISA法測定血清及肺泡灌洗液中花生四烯酸代謝產(chǎn)物PGE_2及LTC_4含量,結(jié)果表明:在COX代謝途徑研究中,與正常組比較,模型血清及肺泡灌洗液中PGE_2含量顯著升高(P0.05),給予黃芩射干湯后含量下降(P0.05)。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測黃芩射干湯可能是通過抑制COX-2表達,降低代謝產(chǎn)物PGE_2的釋放,從而減緩炎癥反應。在LOX代謝途徑研究中,實驗結(jié)果表明,與正常組比較,模型組血清、肺泡灌洗液中LTC_4含量顯著升高(P0.05),說明所建立大鼠感染后咳嗽模型可激活AA代謝LOX途徑,使得致炎性AA代謝產(chǎn)物LTC_4大量生成。給予黃芩射干湯后LTC_4含量有降低趨勢,但是沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測黃芩射干湯對LOX及其代謝產(chǎn)物的抑制作用不明顯。3.應用HPLC-VWD法檢測射干苷、鳶尾黃素、野鳶尾苷、次野鳶尾黃素、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及千層紙素A的含量。方法學驗證實驗表明分別在在0.05625~0.3375μg、0.008656~0.05194μg、0.01613~0.09677μg、0.01134~0.06802μg、0.3146~1.888μg、0.1199~0.7194μg、0.05632~0.3379μg1及0.01035~0.06211μg的范圍內(nèi),與峰面積線性關系較好,r值分別為0.9999、0.9999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.9997及0.9998。結(jié)論:1.黃芩射干湯分子對接實驗結(jié)果表明:黃芩射干湯中16個黃酮類成分與炎癥通路十個靶蛋白中的COX-2及5-LOX的結(jié)合強度最好,其次是P38 MAPK、PLA_2、JNK 3及CYP450 2C9,與JNK 1、LTA_4H、CYP450 2C8及IKK-β結(jié)合稍差。推測黃芩射干湯發(fā)揮抗炎作用的途徑可能與花生四烯酸炎癥通路中的COX-2和5-LOX靶蛋白相關。2.驗證實驗選擇LPS感染大鼠咳嗽模型,黃芩射干湯能明顯抑制模型動物咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥,抑制肺組織中COX-2表達,降低血清及肺泡灌洗液中細胞因子PGE_2含量,表明黃芩射干湯通過干預花生四烯酸炎癥通路中COX-2發(fā)揮抗氣道炎癥作用3.HPLC-VWD法測定射干苷、鳶尾黃素、野鳶尾苷、次野鳶尾黃素、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及千層紙素A含量的方法簡便,靈敏度高,重復性好,可作為黃芩射干湯質(zhì)量控制方法。
【圖文】：

炎癥相關信號傳導網(wǎng)絡

花生四烯酸代謝傳導網(wǎng)絡
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 朱秀美;李秀才;;麻芩射干湯治療哮喘60例臨床觀察[J];中醫(yī)臨床研究;2013年18期

2 劉靜;朱佳麗;;桔梗射干湯治療喉癌術后療效分析[J];世界最新醫(yī)學信息文摘;2018年49期

3 肖映昱;殷玉杰;;山豆射干湯預防鼻咽癌放療毒副反應30例臨床觀察[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2007年10期

4 樸永日;吳粉善;;加味麻黃射干湯治療毛細支氣管炎45例[J];陜西中醫(yī);1992年07期

5 湯國成,張秀霞;桔梗射干湯治療鼻咽癌及喉癌術后放、化療毒副反應[J];新中醫(yī);2001年06期

6 王曉月;邸子真;王光函;劉晶;張穎;;黃芩射干湯中黃酮類成分指紋圖譜的相關性[J];沈陽藥科大學學報;2017年06期

7 王麗娟;瓜蔞射干湯加味治療小兒咳嗽30例[J];陜西中醫(yī)學院學報;2002年01期

8 張建新;楊秀娟;;針灸配合加減射干湯治療急性咽炎24例[J];中醫(yī)耳鼻喉科學研究;2017年03期

9 張穎;王曉月;溫雯;李國信;;RORγt在感染后咳嗽大鼠肺組織中的表達及黃芩射干湯對其干預作用[J];中國新藥雜志;2019年04期

10 田永波;余益萍;侯德祿;梁家川;蔡習春;陳富菊;;麻黃射干湯三種劑型治療毛細支氣管炎的效果比較[J];中外醫(yī)學研究;2019年01期

相關會議論文 前2條

1 殷玉杰;肖映昱;黃革紅;;山豆射干湯預防鼻咽癌放療毒副反應30例臨床觀察[A];第四屆中國腫瘤學術大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學術會議論文集[C];2006年

2 姚力;;葉芹名中醫(yī)治療兒童咳嗽變異性哮喘經(jīng)驗[A];中華中醫(yī)藥學會兒科分會第三十一次學術大會論文匯編[C];2014年

相關碩士學位論文 前2條

1 王曉月;基于分子對接的黃芩射干湯抗炎機制和質(zhì)量控制研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2019年

2 吳彼;胃脘癰古代文獻研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2008年

，

本文編號：2627666