【摘要】：目的:本專題以黃芩射干湯為研究對(duì)象,在文獻(xiàn)研究和前期血清藥物化學(xué)研究的基礎(chǔ)上,篩選出黃芩射干湯有效成分群;利用分子對(duì)接技術(shù),預(yù)測(cè)活性成分與相關(guān)靶點(diǎn)的作用方式及強(qiáng)弱,模擬黃芩射干湯可能的作用機(jī)制;建立大鼠感染后咳嗽模型,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo),從蛋白表達(dá)、體內(nèi)生物標(biāo)記物變化方面驗(yàn)證分子對(duì)接結(jié)果,探討其作用機(jī)制;采用HPLC法,對(duì)黃芩射干湯篩選出的活性成分進(jìn)行質(zhì)量控制研究,上述研究將為黃芩射干湯臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。材料與方法:1.通過查閱相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)以及TCMSP數(shù)據(jù)庫,篩選了16個(gè)已報(bào)道的藥理活性明確的黃酮類化合物,歸納總結(jié)了10個(gè)與氣道炎癥通路相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu),從PDB網(wǎng)站中查找蛋白-配體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),采用Autodock 4.02對(duì)接軟件對(duì)化合物與蛋白進(jìn)行分子對(duì)接研究,通過相對(duì)分值(R=化合物的結(jié)合自由能/共結(jié)晶的結(jié)合自由能)評(píng)估各蛋白與化合物的作用強(qiáng)弱,選擇作用較強(qiáng)的蛋白進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。2.根據(jù)分子對(duì)接的R值結(jié)論,進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。基于大鼠感染后咳嗽模型,采用HE染色法,觀察模型動(dòng)物肺組織氣管、支氣管、肺泡的形態(tài),采用Western-blot方法檢測(cè)動(dòng)物肺組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清、肺泡灌洗液細(xì)胞因子的水平。3.應(yīng)用HPLC-VWD法,對(duì)黃芩射干湯中篩選的黃芩苷等8個(gè)活性成分進(jìn)行含量測(cè)定研究,為黃芩射干湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)。結(jié)果:1.通過分子對(duì)接技術(shù),利用相關(guān)數(shù)據(jù)庫及分子對(duì)接軟件,總結(jié)了黃芩射干湯所含16個(gè)黃酮類化合物的分子量、氫鍵給體、氫鍵受體及脂水分配系數(shù),結(jié)果表明黃芩射干湯黃酮類化合物符合“Lipinski”類藥性規(guī)則,表明黃芩射干湯黃酮具有良好的類藥性。從分子對(duì)接能量相對(duì)分值結(jié)果來看,黃芩射干湯黃酮類成分與炎癥代謝通路靶點(diǎn)中的COX-2及5-LOX的結(jié)合較好,R值均大于0.8,與P38 MAPK、PLA_2、JNK 3及CYP4502C9亞型分子對(duì)接的相對(duì)分值也較好,R值均大于0.7,個(gè)別成分與JNK 1、LTA_4H、CYP450 2C8及IKK-β分子對(duì)接的相對(duì)分值稍差,但都大于0.6;從化合物與蛋白的作用方式看,16個(gè)黃酮類成分均能與10個(gè)蛋白結(jié)合,表明黃芩射干湯所含黃酮類成分可能通過多成分、多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗氣道炎癥作用,其作用途徑可能與AA代謝網(wǎng)絡(luò)中COX-2及5-LOX關(guān)系密切。2.基于分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇LPS感染大鼠咳嗽動(dòng)物模型作為藥物初步作用模式研究的模型。動(dòng)物模型組5 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著增加,給予藥物黃芩射干湯后能抑制模型大鼠5 min內(nèi)咳嗽次數(shù),減輕肺組織中支氣管和周圍炎癥。采用Western-blot法檢測(cè)模型動(dòng)物大鼠肺組織中COX-2和5-LOX蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明:與正常對(duì)照組比較,模型組COX-2、5-LOX蛋白表達(dá)水平顯著升高(P0.05),說明所建立LPS感染大鼠咳嗽模型可激活花生四烯酸代謝通路中的COX-2和5-LOX,給予黃芩射干湯藥物后,COX-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P0.05),而5-LOX蛋白表達(dá)無顯著作用(P0.05),提示黃芩射干湯可能通過抑制花生四烯酸COX-2代謝途徑從而發(fā)揮作用;采用ELISA法測(cè)定血清及肺泡灌洗液中花生四烯酸代謝產(chǎn)物PGE_2及LTC_4含量,結(jié)果表明:在COX代謝途徑研究中,與正常組比較,模型血清及肺泡灌洗液中PGE_2含量顯著升高(P0.05),給予黃芩射干湯后含量下降(P0.05)。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測(cè)黃芩射干湯可能是通過抑制COX-2表達(dá),降低代謝產(chǎn)物PGE_2的釋放,從而減緩炎癥反應(yīng)。在LOX代謝途徑研究中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與正常組比較,模型組血清、肺泡灌洗液中LTC_4含量顯著升高(P0.05),說明所建立大鼠感染后咳嗽模型可激活A(yù)A代謝LOX途徑,使得致炎性AA代謝產(chǎn)物L(fēng)TC_4大量生成。給予黃芩射干湯后LTC_4含量有降低趨勢(shì),但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合蛋白印跡結(jié)果,推測(cè)黃芩射干湯對(duì)LOX及其代謝產(chǎn)物的抑制作用不明顯。3.應(yīng)用HPLC-VWD法檢測(cè)射干苷、鳶尾黃素、野鳶尾苷、次野鳶尾黃素、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及千層紙素A的含量。方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明分別在在0.05625~0.3375μg、0.008656~0.05194μg、0.01613~0.09677μg、0.01134~0.06802μg、0.3146~1.888μg、0.1199~0.7194μg、0.05632~0.3379μg1及0.01035~0.06211μg的范圍內(nèi),與峰面積線性關(guān)系較好,r值分別為0.9999、0.9999、1.000、1.000、1.000、1.000、0.9997及0.9998。結(jié)論:1.黃芩射干湯分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:黃芩射干湯中16個(gè)黃酮類成分與炎癥通路十個(gè)靶蛋白中的COX-2及5-LOX的結(jié)合強(qiáng)度最好,其次是P38 MAPK、PLA_2、JNK 3及CYP450 2C9,與JNK 1、LTA_4H、CYP450 2C8及IKK-β結(jié)合稍差。推測(cè)黃芩射干湯發(fā)揮抗炎作用的途徑可能與花生四烯酸炎癥通路中的COX-2和5-LOX靶蛋白相關(guān)。2.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇LPS感染大鼠咳嗽模型,黃芩射干湯能明顯抑制模型動(dòng)物咳嗽次數(shù),減輕肺組織炎癥,抑制肺組織中COX-2表達(dá),降低血清及肺泡灌洗液中細(xì)胞因子PGE_2含量,表明黃芩射干湯通過干預(yù)花生四烯酸炎癥通路中COX-2發(fā)揮抗氣道炎癥作用3.HPLC-VWD法測(cè)定射干苷、鳶尾黃素、野鳶尾苷、次野鳶尾黃素、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素及千層紙素A含量的方法簡便,靈敏度高,重復(fù)性好,可作為黃芩射干湯質(zhì)量控制方法。
【圖文】：

炎癥相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)

花生四烯酸代謝傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2627666