【摘要】：目的:別歐前胡素是一種從中草藥白芷中提取出來的香豆素,研究發(fā)現(xiàn)中藥白芷及其單體在多種癌癥模型中均表現(xiàn)出抗腫瘤活性,如肺癌,胃癌,乳腺癌等,然而,據(jù)我們所知,別歐前胡素對HL-60細(xì)胞的作用及其機(jī)制尚未明確。本研究旨在探討別歐前胡素對HL-60細(xì)胞的體外抗腫瘤作用及機(jī)制。方法:1.采用CCK-8和臺盼藍(lán)拒染法,明確別歐前胡素對HL-60細(xì)胞增殖能力的影響。2.采用流式細(xì)胞儀檢測別歐前胡素對HL-60細(xì)胞凋亡及周期的影響。3.采用western blot及RT-PCR法檢測在別歐前胡素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2,Bax,cleaved-caspase8,-9,-3蛋白及Bcl-2,Bax mRNA的表達(dá)情況。4.采用Oncomine分析差異基因IARS2在AML患者骨髓及非AML患者骨髓中的表達(dá)情況。5.用Ualcan數(shù)據(jù)庫分析,在AML患者骨髓中IARS2表達(dá)量的高低與患者生存率之間的相關(guān)性。6.采用Western blot及RT-PCR法驗(yàn)證差異基因IARS2在別歐前胡素組及DMSO組中的表達(dá)情況。7.采用微陣列分析,別歐前胡素組與DMSO組差異基因;8.用Western blot分析不同濃度及不同作用時間的別歐前胡素處理HL-60細(xì)胞后MAPK相關(guān)蛋白:P-JNK、JNK、P-P38、P38、P-ERK、ERK表達(dá)情況;并分別使用SP600125、SCH772984、SB203580抑制HL-60細(xì)胞中P-JNK、P-P38、P-ERK的表達(dá),觀察別歐前胡素作用后每組Cleaved-caspase3的表達(dá)情況,明確P-JNK、P-P38、P-ERK在別歐前胡素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡中的作用;9.別歐前胡素處理HL-60細(xì)胞后,HL-60細(xì)胞中PML-RARA的表達(dá)情況。結(jié)果:1.CCK-8檢測結(jié)果提示別歐前胡素處理后的HL-60細(xì)胞增殖明顯受限,且抑制作用隨著用藥濃度的增加逐漸增加,當(dāng)藥物濃度為50μg/ml時其抑制作用最明顯;別歐前胡素作用后的HL-60細(xì)胞臺盼藍(lán)染色率增高。2.隨著別歐前胡素用藥濃度的增加,HL-60細(xì)胞的凋亡率明顯增加,以晚期凋亡為主,將HL-60細(xì)胞阻滯于S期。3.RT-PCR的檢測結(jié)果提示藥物組BAX的表達(dá)較對照組明顯增加,而抑制凋亡因子Bcl-2的表達(dá)受抑;Western blot檢測結(jié)果與RT-PCR一致,且cleaved-caspase-8,-9,-3的蛋白表達(dá)顯著增加。4.Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析表明,與非-AML患者的骨髓相比較,AML患者骨髓中的IARS2基因的表達(dá)明顯增加(P=2.11E-4),IARS2表達(dá)越高患者的預(yù)后越差。5.Western blot及RT-PCR分析表明別歐前胡素處理后的HL-60細(xì)胞中IARS2蛋白及mRNA的表達(dá)逐漸減少,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6.微陣列分析提示,IARS2,IER3,HK3,ETV1,NTHL1,SOX4,PAOX在別歐前胡素組與DMSO組之間存在差異表達(dá),且差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;7.Western blot的分析結(jié)果提示P-JNK/JNK,P-ERK/ERK,P-P38/P38比值隨著用藥濃度的增加逐漸增加(P0.05),當(dāng)P-ERK,P-P38的表達(dá)被抑制時,Cleaved-caspase-3的表達(dá)與單純藥物組比較明顯下調(diào);而抑制P-JNK的表達(dá)后,Cleaved-caspase-3的表達(dá)與別歐前胡素組相比無顯著的差異;8.別歐前胡素處理HL-60細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)PML-RARA的表達(dá)明顯下降。結(jié)論:1.別歐前胡素可抑制HL-60細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)凋亡;2.別歐前胡素主要通過死亡受體途徑及線粒體途徑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡;3.IARS2在AML患者骨髓中高表達(dá),且IARS2表達(dá)量越高患者的預(yù)后越差;4.別歐前胡素可通過抑制IARS2的表達(dá)提高AML患者的生存率;5.ERK及P38 MAPK信號通路的激活在別歐前胡素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用;6.別歐前胡素可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞進(jìn)一步分化。
【圖文】：

圖 3. 別歐前胡素處理后細(xì)胞后線粒體及死亡受體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)。 a.用別歐前胡素（10,30,50μg/ ml）處理 HL-60 細(xì)胞 48 小時，對照組中的細(xì)胞用 DMSO處理 48h，用 Western blot 法檢測 cleaved-caspase8，-9，-3，Bax，Bcl-2 的表達(dá)；b.用 50μg/ ml 別歐前胡素處理細(xì)胞（0h，24h，48h，72h）后，檢測上述蛋白的表達(dá)；c.用不同濃度的藥物處理后 Bax，Bcl-2 mRNA 的表達(dá)；d.別歐前胡素作用后胞質(zhì)及線粒體中細(xì)胞色素 C 的表達(dá)情況。 *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001。3.4 別歐前胡素對 HL-60 細(xì)胞中 IARS2 基因表達(dá)的影響我們的前期研究表明沉默 IARS2 后，HL-60 細(xì)胞的增殖率明顯下降[15]（圖 4a），Oncomine（https://www.oncomine.org/）數(shù)據(jù)庫分析在 AML 患者骨髓中 IARS2 基因的表達(dá)情況時，結(jié)果顯示與正常組骨髓中 IARS2 的表達(dá)量相比 IARS2 在 AML 患者的骨髓中高表達(dá)[112]（圖 4b），此結(jié)果通過了薈萃分析驗(yàn)證，其中，涉及 565 名 AML 患者和 80 名健康受試者的 Meta 分析顯示，AML 患者骨髓中 IARS2 的表達(dá)明顯高于正常人(圖 4c)[113]。通過 Ualcan（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）數(shù)據(jù)庫分析 IARS2的表達(dá)水平與 AML 患者生存期之間關(guān)系的時發(fā)現(xiàn)，IARS2 高表達(dá)患者的生存時間明顯低于 IARS2 中低表達(dá)患者（P = 0.038）（圖 4d），說明下調(diào) IARS2 基因的表達(dá)可

別歐前胡素通過激活 MAPK 信號通路誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞凋亡果發(fā)現(xiàn)用不同劑量的別歐前胡素處理后，HL-60 細(xì)胞中 IARS2 蛋白和 mRNA 的表達(dá)顯著降低（圖 5a，，5b），同時我們用 50μg/ ml 別歐前胡素處理 HL-60（0h，24h，48h，72h），結(jié)果表明 IARS2 的蛋白表達(dá)逐漸降低（圖 5c），Affymetrix Human Gene 1.0 ST平臺用于基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn) IARS2 在藥物組和空白對照組中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，別歐前胡素作用后 IARS2 的表達(dá)明顯下降，P <0.05，| FC | ≥1.5（圖 5d）。
【學(xué)位授予單位】：陜西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2627576