發(fā)布時間：2020-04-14 02:09

【摘要】：研究背景:腹膜透析是終末期腎臟病(End-stage renal disease,ESRD)患者進行腎臟替代治療(renal replacement therapy,RRT)的主要方式之一。研究發(fā)現(xiàn)腹透患者體內(nèi)的慢性炎癥誘導的腹膜間皮細胞發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是引起腹膜纖維化、腹膜結(jié)構和功能改變的重要原因,最終將導致腹膜透析技術失敗、患者退出治療。大腸桿菌等革蘭陰性菌感染引起的腹透相關性腹膜炎在我國南方地區(qū)十分常見�？鄥A具有抑菌、抗炎和抗纖維化等多種藥理作用,本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)苦參堿還可以抑制大腸桿菌生物膜形成。然而,苦參堿對炎癥狀態(tài)下的腹膜間皮細胞發(fā)生EMT的作用研究尚不清楚,因此本實驗用大腸桿菌細胞壁主要成分脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的腹膜間皮細胞EMT模型,結(jié)合相關EMT標志物、miRNAs,探討苦參堿對HPMC發(fā)生EMT的作用。目的:采用LPS誘導人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelium cell,HPMC)發(fā)生EMT的體外模型,通過細胞水平的研究探討苦參堿對HPMCs發(fā)生EMT的作用,同時研究miR-29b、miR-129-5p表達水平的變化。方法:MTT法及細胞形態(tài)學觀察測定LPS、苦參堿對HPMCs生長活性影響,探究用LPS誘導HPMCs發(fā)生EMT模型的適宜濃度以及苦參堿對LPS誘導HPMCs發(fā)生EMT模型作用的有效濃度。劃痕實驗顯微鏡下觀察空白組、LPS組、LPS+苦參堿中劑量組3組0h、8h、16h、24h HPMCs遷移能力的變化。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)測24h空白組、LPS組、LPS+低劑量苦參堿組、LPS+中劑量苦參堿組、LPS+高劑量苦參堿組5組HPMCs上皮細胞標志物鈣粘附蛋白E(E-cadherin)、間充質(zhì)細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、miR-29b、miR-129-5p的表達水平。蛋白免疫印跡分析(western blot analysis)測72h空白組、LPS組、LPS+低劑量苦參堿組、LPS+中劑量苦參堿組、LPS+高劑量苦參堿組5組HPMCs E-cadherin、α-SMA的蛋白含量的變化。結(jié)果:MTT實驗發(fā)現(xiàn)0.1g/l~2.0g/l苦參堿對HPMCs生長活性不影響。0.5ug/ml~20ug/ml LPS對HPMC生長活性不影響。同時參照文獻選擇LPS誘導濃度:10ug/ml,苦參堿干預濃度:0.2g/l(低劑量),0.4g/l(中劑量),0.6g/l(高劑量)。顯微鏡下觀察LPS、LPS+0.6g/l苦參堿刺激HPMCs 72h后細胞生長狀態(tài)與空白組相比不受影響。劃痕實驗顯示LPS處理增強了HPMCs的遷移能力,苦參堿可抑制LPS誘導的HPMCs遷移能力增強。10ug/ml LPS可誘導HPMCs發(fā)生EMT,表現(xiàn)為E-cadherin表達量較空白對照組下降、α-SMA表達量上升�？鄥A可抑制LPS誘導的HPMCs EMT,表現(xiàn)為E-cadherin表達回升,α-SMA表達下降,呈濃度相關性。LPS可誘導HPMCs miR-29b、miR-129-5p表達水平降低,苦參堿干預可提升HPMCs miR-29b、miR-129-5p表達水平,呈濃度相關性。結(jié)論:LPS可誘導HPMCs發(fā)生EMT,減少HPMCs miR-29b、miR-129-5p表達�？鄥A可抑制LPS誘導HPMCs發(fā)生的EMT,使HPMCs miR-29b、miR-129-5p表達回升。
【圖文】：

究生學位論文 苦參堿對脂多糖誘導人腹膜間皮細胞發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化胞劃痕修復實驗結(jié)果劃痕后 8 h LPS組較對照組及LPS+苦參堿組細胞缺口變小。劃組細胞劃痕的缺口逐漸縮小，而對照組及 LPS+苦參堿組細胞劃較寬。劃痕后 24h 后 LPS 組細胞劃痕的缺口消失，而對照組堿組細胞劃痕的缺口仍有明顯缺口。見圖 3

碩士研究生學位論文 苦參堿對脂多糖誘導人腹膜間皮細胞發(fā)生上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化3.4 LPS 誘導及不同濃度苦參堿作用 HPMCs 后 E-cadα-SMA 的 mRNA 表達結(jié)果10ug/ml 的 LPS 誘導處理 HPMC 24h 后,細胞的 E-cadherin 的 達水平降低，α-SMA 的 mRNA 表達水平升高，，與空白對照組相比統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時予 10ug/ml LPS 及苦參堿(0.2g/l,0.4g/l,0預, 細胞與LPS組相比E-cadherin的mRNA表達水平回升，α-SMA表達水平降低，且呈濃度相關性(P<0.05)。見圖 4-3
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2626736