【摘要】：一、研究背景與目的大黃素(Emodin)是大黃、何首烏等多種藥材中的主要有效及毒性成分。大黃素劑量過高或長時間應(yīng)用會產(chǎn)生肝腎損傷,中醫(yī)通常通過炮制、配伍等手段減輕其毒性作用,但具體機理和理論支撐尚不完善。大黃素在體內(nèi)70%以上代謝被UGT代謝,葡萄糖醛酸化轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGT)是II相代謝中重要的解毒酶,受肝腎中多種轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響。本文基于轉(zhuǎn)錄組測序考察了大黃素的肝腎代謝機理并探尋其代謝解毒途徑,為大黃、何首烏等中藥的臨床解毒應(yīng)用提供科學理論依據(jù)。二、研究方法1.本研究將肝腎組織均質(zhì)化后通過差速離心制得富含代謝酶的肝腎微粒體,以染料木素、霉酚酸、齊多夫定分別作為UGTs、UGT1A9和UGT2B7的底物探針驗證肝腎微粒體的活性。2經(jīng)多元線性回歸分析樣本臨床基線資料,利用R軟件分析影響大黃素肝腎代謝的轉(zhuǎn)錄因子和UGTs并比較肝腎差異。3.通過大黃素在55例肝和36例腎微粒體及重組UGT酶中的代謝計算各UGTs在大黃素肝腎代謝中的貢獻度。利用UGT探針底物表征的酶活性對貢獻度大的關(guān)鍵酶進行相關(guān)性驗證。4.采用MTT法檢測大黃素和其代謝產(chǎn)物的細胞毒性。利用siRNA敲低HepG2細胞中的UGT2B7,并用熒光定量PCR技術(shù)和Western-blot技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染效果;考察大黃素在siRNA-UGT2B7-HepG2細胞裂解物中的酶代動力學特征及細胞毒性的變化。三、結(jié)果與結(jié)論1.肝臟中 UGT1A1,UGT1A3,UGT1A4,UGT1A6,UGT1A9,UGT2B4,UGT2B7,UGT2B15 和 UGT2B17 表達豐富;腎臟中 UGT1A6,UGT1A9 和UGT2B7有豐富的表達。2.重組人 UGT 酶實驗中 UGT1A1,UGT1A7,UGT1A8,UGT1A9,UGT1A10,和UGT2B7均參與了大黃素的代謝。大黃素在肝微粒體中的平均代謝速率是腎微粒體中的 1.55 倍(V肝=10.14 ± 0.537 nmol/mg/min;V腎=6.53 ± 0.208 nmol/mg/min)。對大黃素肝代謝貢獻度最大的酶依次是UGT2B7(51.71%)UGT1A1(24.39%)UGT1A9(13.84%);其代謝速率與 UGT1A9 和 UGT2B7酶活性均成正相關(guān)(r UGT1A9=0.4369,P UGT1A9 =0.0019;rUGT2B7=0.6384,PUGT2B70.0001)。對大黃素腎臟代謝貢獻度最高的UGT亞型是UGT2B7(50.49%)和UGT1A9(47.87%);其代謝速率與UGT1A9和UGT2B7的酶活性高度相關(guān)(r UGT1A9=0.7678,P UGT1A90.000 1;rUGT2B7= 0.6338,PUGT2B70.0001)。故 UGT2B7 和UGT1A9是大黃素肝腎代謝中的關(guān)鍵酶。3.大黃素在肝腎微粒體中的代謝個體差異很大。肝臟中UGTs表達量差異僅可解釋大黃素代謝個體差異的15.9%,且UGT1A9的表達量與大黃素肝代謝速率呈正相關(guān)(P=0.044)。在腎臟中UGT表達量差異可以解釋57.0%大黃素代謝個體差異。其中轉(zhuǎn)錄因子HNF4α與UGT1A9/2B7表達及大黃素代謝均呈正相關(guān),NF-κB與UGT1A9/2B7表達及大黃素代謝均呈負相關(guān)。4.大黃素UGT代謝產(chǎn)物對HepG2細胞毒性弱于大黃素。siRNA-UGT2B7-HepG2中UGT2B7的基因和蛋白表達量均顯著降低。大黃素對siRNA-UGT2B7-HepG2的毒性明顯增高(P=0.022);對UGT酶的親和力(Km(siRNA-UGT2B7)=116.39±13.28μM Km(control)=71.75±2.38μM)和清除率(CL csiRNA-UGT2B7)=0.0021ml/min/mg;CL(control)=0.0060ml/min/mg)均下降。故 UGT2B7代謝是大黃素的重要解毒途徑。
【圖文】：

３．２．２線性范圍逡逑分別以染料木素、霉酚酸、齊多夫定的濃度為橫坐標，以其各自的峰面積／逡逑內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如圖２－２所示，表明染料木素逡逑在０．６２５？８０＾Ｍ濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為ｙ－０．０５０１ｘ（Ｒ２＝０．９９９２）；霉酚逡逑酸在３．１２５？２００＾ｉＭ濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為ｙ＝０．０３５２ｘ（Ｒ２＝０．９９９０）；逡逑齊多夫定在９．３７５？６０（ＨｉＭ濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為ｙ＝０．００７９ｘ逡逑（Ｒ２＝０．９９９４）邋＝逡逑Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ邐ＭＰＡ邐ＡＺＴ逡逑＞＝０．０５０１邋ｘ邐）－＝Ｏ．０３５２ｘ邐５，邐ｐ０．００７９＼逡逑Ｒ：＾）．９９９２邐＾邋Ｒ２邋＝０．９９９０邐，邋Ｒ２＝０．９９９４逡逑６－邐Ｘ邋，４．邐／逡逑／邋ｉｌ邋／逡逑１邐０＊邋＾邐＇１邐１邐１邐１邐１邐０＇邋＾邐１邐１邐—邋１邐＇ｉ逡逑０邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐０邐５０邐１邋００邐１５０邐２００邐２５０邐０邐２００邐４００邐６００邐８００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏａ邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋（（ｉＭ）邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ逡逑圖２－２染料木素（Ａ），霉酚酸（Ｂ）和齊多夫定（Ｃ）的標準曲線。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－２．邋Ｔｈｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅｓ邋ｏｆ邋ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ（Ａ）

邋２，，邋４，邋６，邋１２邋ｈ取樣。結(jié)果對各個時間點的霉酚酸峰面積（Ａｓ）與內(nèi)逡逑標峰面積（Ａｉ）的比值作對比，定義Ｏｍｉｎ時霉酚酸的峰面積比值Ａｓ／Ａｉ為１００％，逡逑以考察霉酚酸在ＫＰＩ溶液中的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖２－３所示，高中低濃度的霉酚酸逡逑２６逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2625945