【摘要】：AD是一種漸行性退化的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其病理特征主要有老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失等。其中老年斑主要由Aβ引起,神經(jīng)纖維纏結(jié)主要由Tau的過度磷酸化引起,它們都涉及到了蛋白錯誤折疊和聚集這一問題。大量研究表明,AD的病因與錯誤折疊的蛋白質(zhì)不斷地在腦部積累所導(dǎo)致的神經(jīng)功能異常并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡密切相關(guān)。目前對AD的藥物治療主要集中在AD本身的病理特征上,很少有針對于減少蛋白質(zhì)的錯誤折疊來預(yù)防和治療AD的藥物。而熱休克蛋白在防止蛋白質(zhì)的錯誤折疊和聚集,修復(fù)錯誤折疊的蛋白質(zhì)中發(fā)揮著重要作用,尤其是HSP70。研究表明,HSP70在減少Aβ的聚集與積累、恢復(fù)Tau蛋白體內(nèi)平衡、減輕氧化應(yīng)激程度、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著非常重要的作用,因此可以將HSP70作為抗AD藥物靶點來篩選抗AD藥物。本研究以HSP70啟動子作為目的基因,分別以EGFP和Luciferase作為報告基因,構(gòu)建pHSP70-EGFP和pGL3-HSP70重組載體,轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞,從而構(gòu)建了基于pHSP70-EGFP的定性篩選細胞模型和基于pGL3-HSP70的定量篩選細胞模型。通過對有關(guān)老年癡呆的古方和驗方的收集整理,對復(fù)方中出現(xiàn)的單味藥按照出現(xiàn)的頻率進行排序,以其中的單味藥作為候選藥物,利用定性和定量篩選HSP70啟動子激活劑的細胞模型,優(yōu)先對出現(xiàn)頻率較多的35個單味藥進行篩選,篩選得到四個HSP70啟動子激活劑:黃芩、石菖蒲、蜘蛛香、五味子。用Aβ_(25-35)構(gòu)建AD細胞模型對這四個單味藥水煎液的抗AD效果進行評價,得到的這四個HSP70啟動子激活劑都能減少Aβ_(25-35)的細胞毒性,其中黃芩效果最優(yōu),同時黃芩水煎液還能抑制PC12細胞的凋亡。綜上所述,通過基于HSP70啟動子篩選得到的黃芩水煎液具有作為抗AD藥物候選物的潛力。
【圖文】：

別的 RNA 聚合酶種類不同分為一類啟動子（識別 RNA 聚合酶 I，轉(zhuǎn)錄 rRNA）、二類子（識別 RNA 聚合酶 II，轉(zhuǎn)錄 mRNA）、三類啟動子（識別 RNA 聚合酶 III，轉(zhuǎn)錄 tR其他微小 RNA）。人熱休克蛋白 HSPA1A 是 HSP70 中應(yīng)激可誘導(dǎo)的一種應(yīng)激蛋白，其子屬于二類啟動子。按照轉(zhuǎn)錄模式可將啟動子分為：（1）組成型啟動子：這類啟動子的基因在任何組織器官中的表達基本一樣，不受外界刺激的影響，使基因的表達維持一恒定水平；（2）組織特異型啟動子：這類啟動子對基因的調(diào)控具有組織特異性，，只些特定的組織器官中發(fā)揮作用，特別是在發(fā)育調(diào)節(jié)中發(fā)揮特異的功能；（3）誘導(dǎo)型啟：這類啟動子在機體受到外界環(huán)境的刺激，包括物理刺激和化學(xué)刺激時，能夠特異性，使其控制的基因的表達顯著增高或降低以應(yīng)對環(huán)境的變化，當外界刺激消失時，這動子的活性又回到正常水平。HSPA1A 則屬于誘導(dǎo)型啟動子。二類啟動子一般包括上動子元件（upstream promoter elements, UPE）、TATABox、起始子（initiator）、下游元downstream promoter elements, DPE），如圖 2.1 所示。UPE 含有 GC 框、CCAAT 框。動子區(qū)中，“CG”的含量較高，將富含“CG”的區(qū)域，稱為 CpG 島。CpG 島的甲基阻止所在啟動子的激活。

表 2. 4 構(gòu)建 pHSP70-EGFP 重組載體的 In-Fusion 反應(yīng)體系ble 2.4 In-Fusion reaction system for pHSP70-EGFP recombinant vector 體積的 HSPA1APromoter DNA 片段（55ng/μL） 1.4μL化的 pEGFP-1 載體（32ng/μL） 3.2μLIn-Fusion HD Enzyme Premix 2μL2O 3.4μL0μL，50℃反應(yīng) 30min 后，瞬時離心，置冰上 5min，轉(zhuǎn)化 TO3。將重組的質(zhì)粒命名為 pHSP70-EGFP，提取質(zhì)粒后進行酶切H2O，1μL Cutsmart，4μL pHSP70-EGFP 質(zhì)粒，0.4μL BamH℃酶切 30min，將酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒送測序。測序結(jié)果正確胞實驗，質(zhì)粒大提的方法參照天根生物的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試過程如圖 2.2 所示。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R28

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2626025