【摘要】：目的:胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.)又名山核桃、核桃楸,為胡桃科胡桃屬植物。在民間,采用胡桃楸根、枝和葉水煎液治療腫瘤的方法廣為流傳,并且效果顯著;在臨床中,將胡桃楸與其他中藥材共同制成復方制劑,用于治療腫瘤。正是由于胡桃楸抗腫瘤效果明顯、應用廣泛,使胡桃楸獲得更加廣泛的關注。隨著研究的不斷深入,被分離、鑒定的胡桃楸提取物成分已經(jīng)過百;其中部分化合物在體外研究中已經(jīng)被證實具有抑制腫瘤細胞的作用。但是,除沈陽藥科大學孫志等人對胡桃楸乙醇提取物中8個單體成分的藥代動力學參數(shù)進行研究之外,未見胡桃楸體內過程的相關報道。因此,本論文對胡桃楸水提取體內過程及藥代動力學進行研究,為胡桃楸抗腫瘤有效成分的研究奠定了堅實的基礎,對開發(fā)基于胡桃楸的抗腫瘤中藥具有重要意義。材料與方法:1實驗材料1.1胡桃楸莖枝采摘于遼寧省大連市普蘭店蓮山鎮(zhèn)(2016年4月),并由遼寧中醫(yī)藥大學翟延君教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸(Juglans mandshurica Maxim.),憑證標本編號為ZHI20160406,保存于遼寧中醫(yī)藥大學中藥鑒定研究室。1.2 SPF級ICR小鼠和SD大鼠,均購于遼寧長生生物技術有限公司,實驗動物合格證號為SCXK(遼)2015-0003。2實驗方法2.1采用回流法制備胡桃楸水提取物,應用UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法對胡桃楸水提取物中的化學成分進行系統(tǒng)研究。2.2采用最大給藥量法研究胡桃楸水提取物的急性毒性作用。2.3采用蛋白沉淀法處理生物樣品(血漿、心、肝、脾、肺、腎、膽汁、尿液和糞便);采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析、鑒定樣品中胡桃楸水提取物的原型化合物和代謝物,研究胡桃楸水提取物在體內的分布與代謝。2.4采用HPLC分析方法,研究胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸在大鼠血漿中的藥代動力學參數(shù)。結果:1.按照規(guī)范方法制備胡桃楸水提取物,得率為12.5%,生藥量為8 g/g。其中共有105個化合物被鑒定,分別為54個鞣質、30個有機酸、8個萘衍生物、8個多糖、4個黃酮和1個二芳基庚烷類衍生物。2.灌胃給予ICR小鼠胡桃楸水提取物(9.6 g/m L,以生藥計),灌胃量為0.5m L/20g。灌胃后14天內小鼠的一般生理狀況未見異常,心、肝、脾、肺和腎未發(fā)生肉眼可見病變,最大耐受量為226 g/kg(以生藥計)。3.采用甲醇作為蛋白沉淀劑,加入p H 7.8-8.0的磷酸鹽緩沖液,渦旋后離心取上清液,氮氣吹干,殘渣復溶后,離心,取上清液供HPLC分析。如果采用上述方法處理生物樣品,胡桃楸水提取物中大多數(shù)成分的提取回收率大于75%。4.血漿樣品中共鑒定出33個化合物,包括12個原型化合物和21個代謝物。其中,按結構類型分類,原型化合物可分為4類,包括鞣質、有機酸、萘衍生物和二芳基庚烷類衍生物;代謝物可分為4類,包括葡萄糖醛酸化物、硫酸酯化物、葡萄糖醛酸化硫酸酯化物和異構化反應產(chǎn)物。膽汁樣品中共鑒定出28個化合物,其中,7個原型化合物,包括鞣質、有機酸和萘衍生物;21個代謝物,包括葡萄糖醛酸化物、硫酸酯化物、葡萄糖醛酸化硫酸酯化物和異構化反應產(chǎn)物。尿液樣品中共鑒定出33個化合物,其中,20個原型化合物,包括鞣質、有機酸、黃酮、多糖和萘衍生物;13個代謝物,包括葡萄糖醛酸化物、硫酸酯化物、葡萄糖醛酸化硫酸酯化物和異構化反應產(chǎn)物。糞便樣品中鑒定出71個化合物,其中,67個原型化合物,包括鞣質、有機酸、黃酮、多糖、二芳基庚烷類衍生物和萘衍生物;4個代謝物,包括硫酸酯化物和異構化反應產(chǎn)物。肝樣品中鑒定出蘋果酸和檸檬酸;脾和肺樣品中鑒定出檸檬酸;心和腎樣品中暫未見藥物分布。5.沒食子酸在0.04-5μg/m L范圍內線性良好,最小檢測限(LOQ)為0.006μg/m L,最小定量限(LOD)為0.04μg/m L;日內和日間精密度(RSD)分別為1.8-11.0%和3.5-9.4%,準確度(RE)分別為-0.7-1.3%和-0.5-2.1%;血漿提取回收率為81.2-94.4%;藥代動力學參數(shù)為Cmax=0.64±0.05μg/m L,Tmax=61.80±8.03min,T1/2=184.21±12.73 min,AUC0-t=96.37±10.33μg?min/m L,AUC0-∞=121.59±8.87μg?min/m L。丁香酸在0.04-5μg/m L范圍內線性良好,最小檢測限(LOQ)為0.008μg/m L,最小定量限(LOD)為0.04μg/m L;日內和日間精密度(RSD)分別為4.0-6.9%和2.1-8.8%,準確度(RE)分別為-1.2-4.9%和-4.8-0.8%;血漿提取回收率為84.9-93.6%;藥代動力學參數(shù)為Cmax=0.43±0.04μg/m L,Tmax=30.67±0.92min,T1/2=99.63±5.96min,AUC0-t=40.33±2.42μg?min/m L,AUC0-∞=47.02±3.29μg?min/m L。結論:1.胡桃楸水提取物中的化合物以鞣質和有機酸為主,含有少量的黃酮、萘衍生物和二芳基庚烷類衍生物。2.胡桃楸水提取物無明顯急性毒性作用。3.血漿樣品中代謝物多于原型化合物,原型化合物以鞣質和有機酸為主,被代謝的化合物以萘衍生物、黃酮和二芳基庚烷類衍生物為主。代謝類型分為結合代謝和異構化反應產(chǎn)物,以結合代謝為主。膽汁樣品中原型化合物明顯少于代謝物,原型化合物以鞣質和有機酸為主,被代謝的化合物以黃酮和萘衍生物為主,代謝類型以結合代謝為主。尿液樣品中含原型化合物多于代謝物,原型化合物中含有大量的有機酸。代謝物以有機酸和萘衍生物為主,代謝類型以結合代謝為主。糞便樣品中含有大量原型化合物,僅有4個代謝物,分別為硫酸酯化和異構化反應產(chǎn)物。組織中分布了2個有機酸,分別為蘋果酸和檸檬酸,其中心和腎樣品中未鑒定出原型物質和代謝物。4.鞣質、有機酸、萘衍生物、黃酮和二芳基庚烷類衍生物可以被吸收進入血液,萘衍生物和黃酮類化合物主要從膽汁排泄,鞣質和有機酸主要從腎排泄,二芳基庚烷類衍生物從膽汁和腎排泄。5.應用于胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸在大鼠血漿內藥代動力學研究的HPLC分析方法,專屬性和靈敏度均符合生物樣品分析要求。該研究有助于闡明藥物作用機制和指導臨床用藥。
【圖文】：

-3蘋果酸的二級質譜圖

m/z 169.0140 為沒食子酸的分子離子峰，因此，結構被鑒定為 1,2,6-三沒食子�；咸烟恰Ｈ鐖D 1-2-7、圖1-2-8 所示[M-H]-, 635.0852圖 1-2-7 1,2,6-三沒食子酰基葡萄糖的二級質譜
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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