【摘要】：目的:脊髓損傷(SCI)是一種臨床治療效果較差且難度巨大的外科疾病。全世界范圍內(nèi),每年有大量脊髓損傷新發(fā)病例,其中很多是青壯年,在其人生最活躍的時(shí)期發(fā)生脊髓損傷。患者喪失其活動(dòng)能力,尿便失禁,失去生活自理能力,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的心理負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)損失。黃連素是中國(guó)傳統(tǒng)中藥,用于治療炎癥性腹瀉已應(yīng)用千年。近年來(lái),關(guān)于黃連素研究取得巨大進(jìn)展,黃連素具有抗炎,抗糖尿病,抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。在急性腦損傷,神經(jīng)退行性阿爾茨海默病,亨廷頓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用。黃連素在急性脊髓損傷中的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究,黃連素口服的安全性及其低廉的制作成本將給脊髓損傷患者帶來(lái)福音。研究其在脊髓損傷中的作用機(jī)制及治療效果具有巨大的臨床意義。本研究通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)探究黃連素對(duì)脊髓損傷修復(fù)的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。材料與方法:1.第一部分選取60只雄性SD大鼠,體重范圍200-250mg,將大鼠分為假手術(shù)組(給予椎板切除術(shù));脊髓損傷組(選擇10g打擊器25mm高處打擊,打擊后,脊髓出血紅腫明顯,當(dāng)即下肢抽搐,造模成功,術(shù)后給予等量生理鹽水);脊髓損傷+黃連素組(黃連素混合0.9%生理鹽水配制),以10mg/kg濃度脊髓損傷后連續(xù)腹腔注射給藥3天。觀察脊髓損傷后3天,7天,21天,60天,黃連素對(duì)脊髓損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)恢復(fù)的影響。通過(guò)檢測(cè)脊髓損傷1天,2天,3天脊髓損傷區(qū)域干濕重方法,評(píng)估脊髓水腫程度。通過(guò)BBB評(píng)分評(píng)價(jià)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能。收集脊髓損傷3天SCI大鼠的腦脊液,ELISA檢測(cè)腦脊液中前炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量。收集脊髓損傷3天后SCI大鼠損傷部位脊髓組織,提取上清液,q-PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)。2.第二部分通過(guò)Western blot檢測(cè)脊髓損傷7天后,損傷部位脊髓組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B,ATG16L,ATG7及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)。免疫熒光共定位檢測(cè)脊髓損傷3天后,自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá)并統(tǒng)計(jì)相對(duì)表達(dá)量,免疫熒光觀察脊髓損傷7天后,少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CNPase和自噬相關(guān)蛋白ATG5表達(dá)。統(tǒng)計(jì)CNPase陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,自噬相關(guān)蛋白ATG5陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,和CNPase/ATG5雙陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)尼氏染色觀察脊髓損傷前角神經(jīng)元表達(dá),并計(jì)算神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量,統(tǒng)計(jì)脊髓損傷中心區(qū)域剩余白質(zhì)面積百分比。3.第三部分取出生1天內(nèi)的乳鼠,取其脊髓組織,提取原代脊髓神經(jīng)細(xì)胞做培養(yǎng),脂多糖誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,實(shí)驗(yàn)分組分為:正常對(duì)照組;脂多糖組;脂多糖+黃連素組;脂多糖+黃連素+3-MA組。脂多糖誘導(dǎo)6小時(shí)后給予10uM黃連素及5uM 3-MA處理。選用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。TUNEL染色觀察脂多糖組及黃連素處理組細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)轉(zhuǎn)染沉默Beclin1,通過(guò)Western blot觀察自噬蛋白Beclin1和ATG12表達(dá)。4.第四部分進(jìn)一步探究黃連素誘導(dǎo)自噬的機(jī)制,我們通過(guò)Western blot觀察mTOR通路相關(guān)蛋白p70s6k,p-mTOR表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組分為:正常對(duì)照組;脂多糖處理組;脂多糖+黃連素組。統(tǒng)計(jì)p70s6k及p-mTOR相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:第一部分黃連素減輕了脊髓損傷后炎癥反應(yīng)促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù)1.黃連素組對(duì)比脊髓損傷組明顯減輕了脊髓水腫。2.SD大鼠改良Allen脊髓損傷模型建模成功,術(shù)后大鼠后肢癱瘓,后肢活動(dòng)受限。在脊髓損傷7天,21天,60天,給予黃連素組對(duì)比脊髓損傷組神經(jīng)行為學(xué)BBB評(píng)分明顯提高。3.通過(guò)ELISA檢測(cè)脊髓損傷3天腦脊液中炎癥因子TNF-α,IL-1β含量,發(fā)現(xiàn)黃連素組明顯降低了腦脊液中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量。4.通過(guò)q-PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)黃連素組減少了脊髓損傷部位的炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)。第二部分黃連素誘導(dǎo)了少突膠質(zhì)細(xì)胞自噬減輕了脊髓損傷炎癥反應(yīng)1.在脊髓損傷7天,脊髓損傷組對(duì)比假手術(shù)組,自噬相關(guān)蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3表達(dá)明顯增高,黃連素組對(duì)比脊髓損傷組,進(jìn)一步促進(jìn)了自噬相關(guān)蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7表達(dá),減輕了cleaved caspase-3表達(dá)。2.脊髓損傷3天后,免疫熒光發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá)激活,黃連素組進(jìn)一步促進(jìn)了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá)。3.免疫熒光發(fā)現(xiàn),在假手術(shù)組和脊髓損傷組中都存在CNPase和ATG5陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。脊髓損傷1周后,脊髓損傷組CNPase陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞熒光強(qiáng)度對(duì)比假手術(shù)組明顯降低,黃連素組對(duì)比脊髓損傷組明顯促進(jìn)了CNPase陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。脊髓損傷1周后,黃連素處理組對(duì)比脊髓損傷組ATG5陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞熒光強(qiáng)度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脊髓損傷組對(duì)比假手術(shù)組CNPase/ATG5雙陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞明顯提高,提示少突膠質(zhì)細(xì)胞自噬的激活,黃連素組對(duì)比脊髓損傷組進(jìn)一步促進(jìn)了CNPase/ATG5雙陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)。4.在脊髓損傷2周后,尼氏染色發(fā)現(xiàn),脊髓損傷組神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞形態(tài)萎縮,組織出現(xiàn)空泡。黃連素組對(duì)比脊髓損傷組,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目有所提高。5.尼氏染色發(fā)現(xiàn)黃連素減少了脊髓空洞面積,提高剩余白質(zhì)面積百分比。第三部分黃連素誘導(dǎo)Beclin1依賴自噬減少原代脊髓神經(jīng)細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)1.MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃連素明顯促進(jìn)了脂多糖誘導(dǎo)原代神經(jīng)細(xì)胞炎癥的細(xì)胞存活率。2.TUNEL染色發(fā)現(xiàn)黃連素明顯抑制了脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。3.ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃連素減輕了脂多糖誘導(dǎo)炎癥因子TNF-ɑ和IL-1β含量。4.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂多糖可以促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá),黃連素進(jìn)一步上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá),再沉默Beclin1后,自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ATG12表達(dá)明顯降低。第四部分黃連素通過(guò)p70s6k/mTOR通路調(diào)控脊髓損傷后自噬1.通過(guò)Western blot觀察p70s6k,p-mTOR蛋白表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)脂多糖誘導(dǎo)組對(duì)比正常對(duì)照組p70s6k,p-mTOR蛋白表達(dá)降低。2.黃連素組對(duì)比脂多糖誘導(dǎo)組進(jìn)一步減少了p70s6k,p-mTOR蛋白表達(dá)。結(jié)論:1.本研究發(fā)現(xiàn)黃連素可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù);黃連素減輕了脊髓損傷水腫程度;黃連素減輕脊髓損傷后炎癥因子TNF-α和IL-1β含量和其mRNA表達(dá)。2.脊髓損傷后自噬相關(guān)蛋白激活,黃連素進(jìn)一步促進(jìn)了脊髓損傷后自噬活性;黃連素通過(guò)誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞Beclin1依賴自噬促進(jìn)炎癥因子清除;黃連素促進(jìn)了脊髓損傷前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量,減少了脊髓損傷組織空洞形成,提高了剩余白質(zhì)面積百分比。3.黃連素能夠減輕脂多糖誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞炎癥,其抗炎作用能夠被3-MA抑制,說(shuō)明黃連素通過(guò)誘導(dǎo)自噬減輕炎癥反應(yīng),減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。4.黃連素通過(guò)抑制p70s6k/mTOR通路激活自噬。黃連素通過(guò)誘導(dǎo)Beclin1依賴自噬減輕脊髓損傷炎癥及凋亡,促進(jìn)脊髓損傷神經(jīng)功能修復(fù)。
【圖文】：

圖 1 脊髓損傷 3 天，7 天，21 天，60 天假手術(shù)組，脊髓損傷組，黃連素組的神BBB 評(píng)分。黃連素組在脊髓損傷 7 天，21 天，60 天明顯促進(jìn)了脊髓損傷后神經(jīng)BBB 評(píng)分。n=3, *p< 0.05,黃連素組對(duì)比脊髓損傷組。3.黃連素減輕了脊髓損傷后腦脊液中前炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β含量為了研究黃連素對(duì)炎癥因子作用，我們通過(guò) ELISA 方法檢測(cè)了脊髓損傷后腦前炎癥因子 TNF-α和 IL-1β含量。發(fā)現(xiàn)脊髓損傷 3 天后，腦脊液中細(xì)胞因子 TIL-1β水平明顯升高，，然而，黃連素處理組明顯降低了腦脊液中前炎癥因子 TNIL-1β含量表達(dá)(p<0.05)。（圖 2ab）

1 脊髓損傷 3 天，7 天，21 天，60 天假手術(shù)組，脊髓損傷組，黃連素組的神經(jīng)功BBB 評(píng)分。黃連素組在脊髓損傷 7 天，21 天，60 天明顯促進(jìn)了脊髓損傷后神經(jīng)行為BBB 評(píng)分。n=3, *p< 0.05,黃連素組對(duì)比脊髓損傷組。.黃連素減輕了脊髓損傷后腦脊液中前炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β含量為了研究黃連素對(duì)炎癥因子作用，我們通過(guò) ELISA 方法檢測(cè)了脊髓損傷后腦脊液炎癥因子 TNF-α和 IL-1β含量。發(fā)現(xiàn)脊髓損傷 3 天后，腦脊液中細(xì)胞因子 TNF-αL-1β水平明顯升高，然而，黃連素處理組明顯降低了腦脊液中前炎癥因子 TNF-α和L-1β含量表達(dá)(p<0.05)。（圖 2ab）
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李盛華;柴喜平;王想福;朱煥平;吳錦秋;;中醫(yī)藥治療脊髓損傷的研究進(jìn)展[J];中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志;2010年11期

2 王明新,汪茜,姚共和;中醫(yī)對(duì)脊髓損傷病機(jī)的認(rèn)識(shí)[J];湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2004年06期

本文編號(hào)：2624797