【摘要】：目的:脊髓損傷(SCI)是一種臨床治療效果較差且難度巨大的外科疾病。全世界范圍內,每年有大量脊髓損傷新發(fā)病例,其中很多是青壯年,在其人生最活躍的時期發(fā)生脊髓損傷�；颊邌适浠顒幽芰�,尿便失禁,失去生活自理能力,給家庭和社會帶來沉重的心理負擔和經濟損失。黃連素是中國傳統(tǒng)中藥,用于治療炎癥性腹瀉已應用千年。近年來,關于黃連素研究取得巨大進展,黃連素具有抗炎,抗糖尿病,抗腫瘤等多種生物學效應。在急性腦損傷,神經退行性阿爾茨海默病,亨廷頓等中樞神經系統(tǒng)疾病中具有神經保護作用。黃連素在急性脊髓損傷中的神經保護機制有待進一步研究,黃連素口服的安全性及其低廉的制作成本將給脊髓損傷患者帶來福音。研究其在脊髓損傷中的作用機制及治療效果具有巨大的臨床意義。本研究通過體內體外實驗探究黃連素對脊髓損傷修復的神經保護作用及機制。材料與方法:1.第一部分選取60只雄性SD大鼠,體重范圍200-250mg,將大鼠分為假手術組(給予椎板切除術);脊髓損傷組(選擇10g打擊器25mm高處打擊,打擊后,脊髓出血紅腫明顯,當即下肢抽搐,造模成功,術后給予等量生理鹽水);脊髓損傷+黃連素組(黃連素混合0.9%生理鹽水配制),以10mg/kg濃度脊髓損傷后連續(xù)腹腔注射給藥3天。觀察脊髓損傷后3天,7天,21天,60天,黃連素對脊髓損傷大鼠神經行為學恢復的影響。通過檢測脊髓損傷1天,2天,3天脊髓損傷區(qū)域干濕重方法,評估脊髓水腫程度。通過BBB評分評價脊髓損傷大鼠運動功能。收集脊髓損傷3天SCI大鼠的腦脊液,ELISA檢測腦脊液中前炎癥因子TNF-α和IL-1β的含量。收集脊髓損傷3天后SCI大鼠損傷部位脊髓組織,提取上清液,q-PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達。2.第二部分通過Western blot檢測脊髓損傷7天后,損傷部位脊髓組織中自噬相關蛋白LC3B,ATG16L,ATG7及凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達。免疫熒光共定位檢測脊髓損傷3天后,自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達并統(tǒng)計相對表達量,免疫熒光觀察脊髓損傷7天后,少突膠質細胞標志物CNPase和自噬相關蛋白ATG5表達。統(tǒng)計CNPase陽性表達細胞,自噬相關蛋白ATG5陽性表達細胞,和CNPase/ATG5雙陽性表達神經細胞數目。通過尼氏染色觀察脊髓損傷前角神經元表達,并計算神經細胞數量,統(tǒng)計脊髓損傷中心區(qū)域剩余白質面積百分比。3.第三部分取出生1天內的乳鼠,取其脊髓組織,提取原代脊髓神經細胞做培養(yǎng),脂多糖誘導神經細胞炎癥反應模型,實驗分組分為:正常對照組;脂多糖組;脂多糖+黃連素組;脂多糖+黃連素+3-MA組。脂多糖誘導6小時后給予10uM黃連素及5uM 3-MA處理。選用MTT法檢測細胞生存率。TUNEL染色觀察脂多糖組及黃連素處理組細胞凋亡情況。通過轉染沉默Beclin1,通過Western blot觀察自噬蛋白Beclin1和ATG12表達。4.第四部分進一步探究黃連素誘導自噬的機制,我們通過Western blot觀察mTOR通路相關蛋白p70s6k,p-mTOR表達。實驗分組分為:正常對照組;脂多糖處理組;脂多糖+黃連素組。統(tǒng)計p70s6k及p-mTOR相對表達量。結果:第一部分黃連素減輕了脊髓損傷后炎癥反應促進了神經功能恢復1.黃連素組對比脊髓損傷組明顯減輕了脊髓水腫。2.SD大鼠改良Allen脊髓損傷模型建模成功,術后大鼠后肢癱瘓,后肢活動受限。在脊髓損傷7天,21天,60天,給予黃連素組對比脊髓損傷組神經行為學BBB評分明顯提高。3.通過ELISA檢測脊髓損傷3天腦脊液中炎癥因子TNF-α,IL-1β含量,發(fā)現黃連素組明顯降低了腦脊液中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量。4.通過q-PCR檢測炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達,發(fā)現黃連素組減少了脊髓損傷部位的炎癥因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達。第二部分黃連素誘導了少突膠質細胞自噬減輕了脊髓損傷炎癥反應1.在脊髓損傷7天,脊髓損傷組對比假手術組,自噬相關蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7和凋亡相關蛋白cleaved caspase-3表達明顯增高,黃連素組對比脊髓損傷組,進一步促進了自噬相關蛋白LC3B-I/II,ATG16L,ATG7表達,減輕了cleaved caspase-3表達。2.脊髓損傷3天后,免疫熒光發(fā)現脊髓損傷后自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達激活,黃連素組進一步促進了自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達。3.免疫熒光發(fā)現,在假手術組和脊髓損傷組中都存在CNPase和ATG5陽性神經細胞表達。脊髓損傷1周后,脊髓損傷組CNPase陽性神經細胞熒光強度對比假手術組明顯降低,黃連素組對比脊髓損傷組明顯促進了CNPase陽性神經細胞表達。脊髓損傷1周后,黃連素處理組對比脊髓損傷組ATG5陽性神經細胞熒光強度沒有統(tǒng)計學意義。脊髓損傷組對比假手術組CNPase/ATG5雙陽性神經細胞明顯提高,提示少突膠質細胞自噬的激活,黃連素組對比脊髓損傷組進一步促進了CNPase/ATG5雙陽性神經細胞表達。4.在脊髓損傷2周后,尼氏染色發(fā)現,脊髓損傷組神經細胞數目明顯減少,細胞形態(tài)萎縮,組織出現空泡。黃連素組對比脊髓損傷組,神經細胞數目有所提高。5.尼氏染色發(fā)現黃連素減少了脊髓空洞面積,提高剩余白質面積百分比。第三部分黃連素誘導Beclin1依賴自噬減少原代脊髓神經細胞中脂多糖誘導炎癥反應1.MTT檢測發(fā)現黃連素明顯促進了脂多糖誘導原代神經細胞炎癥的細胞存活率。2.TUNEL染色發(fā)現黃連素明顯抑制了脂多糖誘導的神經細胞凋亡。3.ELISA檢測發(fā)現黃連素減輕了脂多糖誘導炎癥因子TNF-ɑ和IL-1β含量。4.實驗發(fā)現脂多糖可以促進自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達,黃連素進一步上調了自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達,再沉默Beclin1后,自噬相關蛋白Beclin1和ATG12表達明顯降低。第四部分黃連素通過p70s6k/mTOR通路調控脊髓損傷后自噬1.通過Western blot觀察p70s6k,p-mTOR蛋白表達情況,發(fā)現脂多糖誘導組對比正常對照組p70s6k,p-mTOR蛋白表達降低。2.黃連素組對比脂多糖誘導組進一步減少了p70s6k,p-mTOR蛋白表達。結論:1.本研究發(fā)現黃連素可以促進脊髓損傷大鼠神經功能恢復;黃連素減輕了脊髓損傷水腫程度;黃連素減輕脊髓損傷后炎癥因子TNF-α和IL-1β含量和其mRNA表達。2.脊髓損傷后自噬相關蛋白激活,黃連素進一步促進了脊髓損傷后自噬活性;黃連素通過誘導少突膠質細胞Beclin1依賴自噬促進炎癥因子清除;黃連素促進了脊髓損傷前角運動神經細胞數量,減少了脊髓損傷組織空洞形成,提高了剩余白質面積百分比。3.黃連素能夠減輕脂多糖誘導神經細胞炎癥,其抗炎作用能夠被3-MA抑制,說明黃連素通過誘導自噬減輕炎癥反應,減少神經細胞凋亡。4.黃連素通過抑制p70s6k/mTOR通路激活自噬。黃連素通過誘導Beclin1依賴自噬減輕脊髓損傷炎癥及凋亡,促進脊髓損傷神經功能修復。
【圖文】：

圖 1 脊髓損傷 3 天，7 天，21 天，60 天假手術組，脊髓損傷組，黃連素組的神BBB 評分。黃連素組在脊髓損傷 7 天，21 天，60 天明顯促進了脊髓損傷后神經BBB 評分。n=3, *p< 0.05,黃連素組對比脊髓損傷組。3.黃連素減輕了脊髓損傷后腦脊液中前炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β含量為了研究黃連素對炎癥因子作用，我們通過 ELISA 方法檢測了脊髓損傷后腦前炎癥因子 TNF-α和 IL-1β含量。發(fā)現脊髓損傷 3 天后，腦脊液中細胞因子 TIL-1β水平明顯升高，，然而，黃連素處理組明顯降低了腦脊液中前炎癥因子 TNIL-1β含量表達(p<0.05)。（圖 2ab）

1 脊髓損傷 3 天，7 天，21 天，60 天假手術組，脊髓損傷組，黃連素組的神經功BBB 評分。黃連素組在脊髓損傷 7 天，21 天，60 天明顯促進了脊髓損傷后神經行為BBB 評分。n=3, *p< 0.05,黃連素組對比脊髓損傷組。.黃連素減輕了脊髓損傷后腦脊液中前炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β含量為了研究黃連素對炎癥因子作用，我們通過 ELISA 方法檢測了脊髓損傷后腦脊液炎癥因子 TNF-α和 IL-1β含量。發(fā)現脊髓損傷 3 天后，腦脊液中細胞因子 TNF-αL-1β水平明顯升高，然而，黃連素處理組明顯降低了腦脊液中前炎癥因子 TNF-α和L-1β含量表達(p<0.05)。（圖 2ab）
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 李盛華;柴喜平;王想福;朱煥平;吳錦秋;;中醫(yī)藥治療脊髓損傷的研究進展[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2010年11期

2 王明新,汪茜,姚共和;中醫(yī)對脊髓損傷病機的認識[J];湖南中醫(yī)藥導報;2004年06期

本文編號：2624797