【摘要】：目的:增液湯作為我國的傳統(tǒng)古方,目前在臨床上廣泛用于治療津虧便秘以及其它慢性疾病。但是大多數(shù)關(guān)于增液湯的研究都是基于它的藥理作用,仍然缺乏一種綜合的、系統(tǒng)的研究去進一步揭示其發(fā)揮治療效果的特定的作用途徑或潛在的作用靶點。近些年來,人們開始意識到腸道菌群與腸道生理功能的關(guān)系,這提示了我們,增液湯發(fā)揮治療作用的靶點也許與腸道菌群相關(guān)。因此,本論文從分子生物學、腸道微生態(tài)學和代謝組學的角度探究增液湯治療便秘的靶點,更深入地闡明增液湯藥效的本質(zhì),解釋腸道微生態(tài)群落與宿主代謝組在便秘的發(fā)病機制以及增液湯的治療過程中的作用。方法:(1)采用限水法疊加灌胃鹽酸洛哌丁胺和皮下注射D-半乳糖的方法建立津虧便秘衰老模型。并通過宏觀指標:體重、24小時排便量和進食量;生化指標:SOD值(超氧化物歧化酶)和MDA值(丙二醛);生理指標:小腸墨汁推進率、小腸含水率、結(jié)腸粘膜厚度、皮膚真皮層厚度;病理切片:結(jié)腸粘膜細胞狀態(tài)、皮膚真皮層細胞狀態(tài),來評價造模效果。并在模型成功之后給予增液湯治療,用上述指標來評價治療效果。(2)在動物實驗期間于不同時間點收集大鼠的糞便和尿樣。其中,部分糞樣被用來進行生物信息學分析,包括DGGE(變性梯度凝膠電泳)和16S RNA測序。另外一部分糞樣和尿樣則送去打核磁進行代謝組學分析。在分析代謝物時,我們先對核磁譜的峰進行歸屬。然后對所得積分數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析,篩選與模型以及給藥相關(guān)的差異代謝物,通過代謝通路分析,找到影響的生物相關(guān)代謝通路。解釋對宿主代謝的調(diào)控作用。在腸道微生態(tài)學分析中,我們先利用PCR-DGGE(聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù))研究津虧衰老便秘大鼠以及增液湯干預(yù)后的腸道菌群指紋圖譜,并探討腸道菌群隨時間變化趨勢。再利用16S rDNA測序技術(shù)分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)與多樣性。最后通過LEfSe分析和PICRUSt分析篩選津虧衰老便秘證模型大鼠腸道菌群生物標志物并預(yù)測其功能,最后利用宏基因測序去驗證代謝功能。結(jié)果:(1)在造模結(jié)束后,模型組大鼠出現(xiàn)體重下降,食欲不振,排便量減少的情況,在解剖后我們發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠小腸墨汁推進率、小腸含水率、結(jié)腸粘膜厚度和皮膚真皮層厚度均明顯低于正常組,并且模型組大鼠的SOD值顯著低于正常組而MDA值顯著高于正常組。在藥物干預(yù)后,上述指標均有不同程度的改善。(2)代謝組學結(jié)果顯示:選取造模結(jié)束即第28天的數(shù)據(jù)進行解譜,共解出了105種內(nèi)源性代謝物,其中尿樣代謝物74個,糞樣代謝物56個。經(jīng)過多元統(tǒng)計學分析,我們進行模型驗證,驗證方法為排列驗證(permutation test)和CV-ANOVA。實驗證明造模第28天時,所有的模型參數(shù)均符合要求且和驗證均通過。同樣的,借助多變量統(tǒng)計分析方法,我們找出了尿樣和糞樣中的差異代謝物。其中尿樣27個,糞樣23個。在代謝通路分析中,我們發(fā)現(xiàn)造模后對宿主的影響,分別是:干擾了能量代謝;抑制了丁酸的合成;干擾了膽堿和甲烷的生物活性;擾亂了肝腎功能;干擾了體內(nèi)氨基酸的代謝。在給予藥物治療后,藥物干預(yù)導(dǎo)致了模型組中20個代謝物發(fā)生顯著變化(尿樣12,糞樣9,共同1)。且這些代謝物的變化趨勢與造模時期相反,影響的代謝通路主要為能量代謝,甲烷代謝,氨基酸代謝和細菌毒素代謝。(3)腸道微生態(tài)學結(jié)果顯示:造模結(jié)束后,正常組與模型組的腸道菌群結(jié)構(gòu)上有明顯差異,并且該差異隨著增液湯干預(yù)后逐漸減小。在生物多樣性分析中,模型組的α-多樣性最低并與正常組存在顯著差異,而給藥組與正常組接近無顯著差異。同樣的,模型組的β-多樣性與正常組差別較大,而正常組與給藥組差別較小。LEfSe分析中,與模型組相比較,給藥組和正常組呈現(xiàn)較低水平的Helicobacteraceae,Desulfovibrionaceae(包括Desulfovibrio),Ruminococcaceae(包括Ruminococcus),Lactobacillaceae(包括Lactobacillus),Prevotellaceae(包括Prevotella)和Dorea,以及較高水平的Aeromonadaceae、Oxalobacteraceae(包括Oxalobacter)、Veillonellaceae、Clostridiaceae(包括Clostridium)和Roseburia。通過PICRUSt分析對生物標志群落進行功能預(yù)測,整個造模和給藥過程影響顯著的代謝功能有果糖和甘露糖代謝、甲烷代謝、賴氨酸生物合成、丙酮酸代謝、戊糖磷酸途徑、細菌毒素、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解和谷氨酸代謝。結(jié)論:本研究成功的建立了SD大鼠的津虧便秘衰老模型。從代謝組學與腸道微生態(tài)學的角度去研究造模及藥物干預(yù)對大鼠的影響作用,找出了主要發(fā)生改變并與疾病相關(guān)的代謝通路和腸道菌群。深入探討了機體在不同狀態(tài)下的腸道菌群組成分布、宿主糞便與尿液的代謝組學變化。闡明了在津虧衰老便秘時腸道菌群與宿主代謝的相互關(guān)系以及增液湯對模型大鼠的腸道菌群和代謝的調(diào)控作用,為便秘的治療和增液湯的進一步開發(fā)提供有效的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生學位論文試疾病相關(guān)指標去評價造模和給藥效果。利用 600MHz NMR 技術(shù)對尿樣和糞樣謝物的變化情況進行追蹤監(jiān)測，并尋找在造模和藥物干預(yù)過程中的差異代謝物進代謝通路分析。同時，利用 PCR-DGGE 技術(shù)和 16S 高通量測序技術(shù)去對大鼠腸群的結(jié)構(gòu)組成變化進行分析，鑒定出差異菌群并確定其具有的代謝功能，并結(jié)合組學信息對腸道菌群的代謝功能與宿主的代謝通路之間的相關(guān)性進行整合。本研在從微生態(tài)學的角度初步探討增液湯影響腸道菌群結(jié)構(gòu)治療便秘的機制，為臨床液湯的治療作用以及便秘的防治補充理論基礎(chǔ)，，也為人類研究疾病與治療藥物之相互作用關(guān)系提供新的思路和方法。本文研究思路及技術(shù)線路圖如下（圖 1-1）：

模型組造模 5 周后，分為恢復(fù)組（n = 10）和給藥組（n = 10），給藥組給予增液湯進行干預(yù) 4 周，給藥濃度為 63 mg/mL，給藥體積為 10 mL/kg�；謴�(fù)組與正常組進行對照處理。所有組均自由進食、飲水。2.2.2 增液湯配制在 30 g 玄參，24 g 地黃，24 g 麥冬加入 8 倍量的水，浸泡 4 小時，煮沸 1 小時，第一次過濾，濾渣再加入 6 倍量的水重新煮沸 1 小時，第二次過濾。合并兩次濾液，濃縮至每 1 mL 溶液含 1 g 生藥量。2.2.3 樣品收集分別于造模前 1 天，造模第 21 天、第 35 天、第 49 天以及第 63 天，收集大鼠的尿液、糞便。并在第 35 天和第 63 天收集血樣。收集完后對尿樣和血樣進行離心處理，然后取其上清液進行分裝后保存于-80℃冰箱超低溫冰箱，避免反復(fù)凍融。收集完最后一次尿液和糞便后，大鼠在當天晚上 8 點至次日早上 8 點禁食，次日處死大鼠，收集頸背部皮膚、小腸、結(jié)腸待后續(xù)分析。具體實驗與采樣流程見圖 2-1。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2624178