發(fā)布時(shí)間：2020-04-12 02:44

【摘要】：目的:增液湯作為我國(guó)的傳統(tǒng)古方,目前在臨床上廣泛用于治療津虧便秘以及其它慢性疾病。但是大多數(shù)關(guān)于增液湯的研究都是基于它的藥理作用,仍然缺乏一種綜合的、系統(tǒng)的研究去進(jìn)一步揭示其發(fā)揮治療效果的特定的作用途徑或潛在的作用靶點(diǎn)。近些年來(lái),人們開(kāi)始意識(shí)到腸道菌群與腸道生理功能的關(guān)系,這提示了我們,增液湯發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)也許與腸道菌群相關(guān)。因此,本論文從分子生物學(xué)、腸道微生態(tài)學(xué)和代謝組學(xué)的角度探究增液湯治療便秘的靶點(diǎn),更深入地闡明增液湯藥效的本質(zhì),解釋腸道微生態(tài)群落與宿主代謝組在便秘的發(fā)病機(jī)制以及增液湯的治療過(guò)程中的作用。方法:(1)采用限水法疊加灌胃鹽酸洛哌丁胺和皮下注射D-半乳糖的方法建立津虧便秘衰老模型。并通過(guò)宏觀指標(biāo):體重、24小時(shí)排便量和進(jìn)食量;生化指標(biāo):SOD值(超氧化物歧化酶)和MDA值(丙二醛);生理指標(biāo):小腸墨汁推進(jìn)率、小腸含水率、結(jié)腸粘膜厚度、皮膚真皮層厚度;病理切片:結(jié)腸粘膜細(xì)胞狀態(tài)、皮膚真皮層細(xì)胞狀態(tài),來(lái)評(píng)價(jià)造模效果。并在模型成功之后給予增液湯治療,用上述指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)治療效果。(2)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間于不同時(shí)間點(diǎn)收集大鼠的糞便和尿樣。其中,部分糞樣被用來(lái)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,包括DGGE(變性梯度凝膠電泳)和16S RNA測(cè)序。另外一部分糞樣和尿樣則送去打核磁進(jìn)行代謝組學(xué)分析。在分析代謝物時(shí),我們先對(duì)核磁譜的峰進(jìn)行歸屬。然后對(duì)所得積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,篩選與模型以及給藥相關(guān)的差異代謝物,通過(guò)代謝通路分析,找到影響的生物相關(guān)代謝通路。解釋對(duì)宿主代謝的調(diào)控作用。在腸道微生態(tài)學(xué)分析中,我們先利用PCR-DGGE(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù))研究津虧衰老便秘大鼠以及增液湯干預(yù)后的腸道菌群指紋圖譜,并探討腸道菌群隨時(shí)間變化趨勢(shì)。再利用16S rDNA測(cè)序技術(shù)分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)與多樣性。最后通過(guò)LEfSe分析和PICRUSt分析篩選津虧衰老便秘證模型大鼠腸道菌群生物標(biāo)志物并預(yù)測(cè)其功能,最后利用宏基因測(cè)序去驗(yàn)證代謝功能。結(jié)果:(1)在造模結(jié)束后,模型組大鼠出現(xiàn)體重下降,食欲不振,排便量減少的情況,在解剖后我們發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠小腸墨汁推進(jìn)率、小腸含水率、結(jié)腸粘膜厚度和皮膚真皮層厚度均明顯低于正常組,并且模型組大鼠的SOD值顯著低于正常組而MDA值顯著高于正常組。在藥物干預(yù)后,上述指標(biāo)均有不同程度的改善。(2)代謝組學(xué)結(jié)果顯示:選取造模結(jié)束即第28天的數(shù)據(jù)進(jìn)行解譜,共解出了105種內(nèi)源性代謝物,其中尿樣代謝物74個(gè),糞樣代謝物56個(gè)。經(jīng)過(guò)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,我們進(jìn)行模型驗(yàn)證,驗(yàn)證方法為排列驗(yàn)證(permutation test)和CV-ANOVA。實(shí)驗(yàn)證明造模第28天時(shí),所有的模型參數(shù)均符合要求且和驗(yàn)證均通過(guò)。同樣的,借助多變量統(tǒng)計(jì)分析方法,我們找出了尿樣和糞樣中的差異代謝物。其中尿樣27個(gè),糞樣23個(gè)。在代謝通路分析中,我們發(fā)現(xiàn)造模后對(duì)宿主的影響,分別是:干擾了能量代謝;抑制了丁酸的合成;干擾了膽堿和甲烷的生物活性;擾亂了肝腎功能;干擾了體內(nèi)氨基酸的代謝。在給予藥物治療后,藥物干預(yù)導(dǎo)致了模型組中20個(gè)代謝物發(fā)生顯著變化(尿樣12,糞樣9,共同1)。且這些代謝物的變化趨勢(shì)與造模時(shí)期相反,影響的代謝通路主要為能量代謝,甲烷代謝,氨基酸代謝和細(xì)菌毒素代謝。(3)腸道微生態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:造模結(jié)束后,正常組與模型組的腸道菌群結(jié)構(gòu)上有明顯差異,并且該差異隨著增液湯干預(yù)后逐漸減小。在生物多樣性分析中,模型組的α-多樣性最低并與正常組存在顯著差異,而給藥組與正常組接近無(wú)顯著差異。同樣的,模型組的β-多樣性與正常組差別較大,而正常組與給藥組差別較小。LEfSe分析中,與模型組相比較,給藥組和正常組呈現(xiàn)較低水平的Helicobacteraceae,Desulfovibrionaceae(包括Desulfovibrio),Ruminococcaceae(包括Ruminococcus),Lactobacillaceae(包括Lactobacillus),Prevotellaceae(包括Prevotella)和Dorea,以及較高水平的Aeromonadaceae、Oxalobacteraceae(包括Oxalobacter)、Veillonellaceae、Clostridiaceae(包括Clostridium)和Roseburia。通過(guò)PICRUSt分析對(duì)生物標(biāo)志群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè),整個(gè)造模和給藥過(guò)程影響顯著的代謝功能有果糖和甘露糖代謝、甲烷代謝、賴氨酸生物合成、丙酮酸代謝、戊糖磷酸途徑、細(xì)菌毒素、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解和谷氨酸代謝。結(jié)論:本研究成功的建立了SD大鼠的津虧便秘衰老模型。從代謝組學(xué)與腸道微生態(tài)學(xué)的角度去研究造模及藥物干預(yù)對(duì)大鼠的影響作用,找出了主要發(fā)生改變并與疾病相關(guān)的代謝通路和腸道菌群。深入探討了機(jī)體在不同狀態(tài)下的腸道菌群組成分布、宿主糞便與尿液的代謝組學(xué)變化。闡明了在津虧衰老便秘時(shí)腸道菌群與宿主代謝的相互關(guān)系以及增液湯對(duì)模型大鼠的腸道菌群和代謝的調(diào)控作用,為便秘的治療和增液湯的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供有效的理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文試疾病相關(guān)指標(biāo)去評(píng)價(jià)造模和給藥效果。利用 600MHz NMR 技術(shù)對(duì)尿樣和糞樣謝物的變化情況進(jìn)行追蹤監(jiān)測(cè)，并尋找在造模和藥物干預(yù)過(guò)程中的差異代謝物進(jìn)代謝通路分析。同時(shí)，利用 PCR-DGGE 技術(shù)和 16S 高通量測(cè)序技術(shù)去對(duì)大鼠腸群的結(jié)構(gòu)組成變化進(jìn)行分析，鑒定出差異菌群并確定其具有的代謝功能，并結(jié)合組學(xué)信息對(duì)腸道菌群的代謝功能與宿主的代謝通路之間的相關(guān)性進(jìn)行整合。本研在從微生態(tài)學(xué)的角度初步探討增液湯影響腸道菌群結(jié)構(gòu)治療便秘的機(jī)制，為臨床液湯的治療作用以及便秘的防治補(bǔ)充理論基礎(chǔ)，，也為人類研究疾病與治療藥物之相互作用關(guān)系提供新的思路和方法。本文研究思路及技術(shù)線路圖如下（圖 1-1）：

模型組造模 5 周后，分為恢復(fù)組（n = 10）和給藥組（n = 10），給藥組給予增液湯進(jìn)行干預(yù) 4 周，給藥濃度為 63 mg/mL，給藥體積為 10 mL/kg�；謴�(fù)組與正常組進(jìn)行對(duì)照處理。所有組均自由進(jìn)食、飲水。2.2.2 增液湯配制在 30 g 玄參，24 g 地黃，24 g 麥冬加入 8 倍量的水，浸泡 4 小時(shí)，煮沸 1 小時(shí)，第一次過(guò)濾，濾渣再加入 6 倍量的水重新煮沸 1 小時(shí)，第二次過(guò)濾。合并兩次濾液，濃縮至每 1 mL 溶液含 1 g 生藥量。2.2.3 樣品收集分別于造模前 1 天，造模第 21 天、第 35 天、第 49 天以及第 63 天，收集大鼠的尿液、糞便。并在第 35 天和第 63 天收集血樣。收集完后對(duì)尿樣和血樣進(jìn)行離心處理，然后取其上清液進(jìn)行分裝后保存于-80℃冰箱超低溫冰箱，避免反復(fù)凍融。收集完最后一次尿液和糞便后，大鼠在當(dāng)天晚上 8 點(diǎn)至次日早上 8 點(diǎn)禁食，次日處死大鼠，收集頸背部皮膚、小腸、結(jié)腸待后續(xù)分析。具體實(shí)驗(yàn)與采樣流程見(jiàn)圖 2-1。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2624178