【摘要】：目的:探討信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)在蛇毒蛋白C激活劑(PCA)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)表達(dá)組織因子(TF)過(guò)程中的作用。方法:HUVEC體外常規(guī)培養(yǎng),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組,分別是空白對(duì)照組、PCA組、LPS組和PCA+LPS組。DMEM完全培養(yǎng)基直接加入至空白對(duì)照組,濃度為1.25μg/ml的PCA溶液加入PCA組,LPS組加入0.1μg/ml LPS溶液,濃度為1.25μg/ml PCA和0.1μg/ml LPS的混合液加入到PCA+LPS組。培養(yǎng)12h后,直接在熒光倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài),Hoechst33258檢測(cè)PCA作用后細(xì)胞核的形態(tài)變化,MTT法檢測(cè)HUVEC活力,免疫組化法檢測(cè)TRAF6蛋白在細(xì)胞中的分布,免疫熒光染色檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是否被激活-核轉(zhuǎn)運(yùn),Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB p65、FOS、JUN和TF蛋白的表達(dá),qPCR測(cè)定TF的mRNA在HUVEC的表達(dá),ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TF的含量。結(jié)果:1.PCA對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)及生長(zhǎng)增殖性的影響倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組HUVEC為橢圓、多變或梭形,邊界清楚,胞質(zhì)飽滿,呈鋪路石狀均勻貼壁生長(zhǎng)。與對(duì)照組比較,LPS組細(xì)胞明顯梭形化,形態(tài)不規(guī)則,體積縮小,但邊界仍清楚,PCA組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。正常組的HUVEC核在顯微鏡下呈均勻藍(lán)色,邊界清楚,色澤均勻。LPS組可見細(xì)胞核形態(tài)改變,缺如,呈片狀濃染。而在PCA組與PCA+LPS組HUVEC核在顯微鏡下仍呈均勻藍(lán)色,邊界清楚,色澤清楚。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LPS組與對(duì)照組相比細(xì)胞活力明顯降低(P0.01),PCA+LPS組的細(xì)胞活力比LPS組微升(P0.05)。2.PCA(1.25μg/ml)能降低LPS引起的細(xì)胞內(nèi)TRAF6蛋白表達(dá)免疫組化法檢測(cè)TRAF6蛋白活化結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組細(xì)胞呈多邊或梭形,胞質(zhì)內(nèi)無(wú)明顯黃染顆粒,細(xì)胞邊界清晰。LPS組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃染顆粒,胞質(zhì)染色加深,TRAF6平均光密度值升高,與對(duì)照組比較,可見TRAF6蛋白的表達(dá)量明顯增加(P0.01)。而LPS+PCA實(shí)驗(yàn)組與LPS組比較,細(xì)胞形態(tài)正常,胞質(zhì)黃染顆粒不明顯,TRAF6平均光密度明顯小于LPS組(P0.01)。3.PCA(1.25μg/ml)可影響LPS引起的細(xì)胞核內(nèi)NF-κB被激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化,結(jié)果顯示,對(duì)照組HUVEC胞核內(nèi)紅色熒光較少,強(qiáng)度微弱。與對(duì)照組進(jìn)行比較,在多數(shù)細(xì)胞中LPS組細(xì)胞胞核中紅色熒光明顯增多,熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P0.01),可見NF-κB明顯被激活并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi);PCA組細(xì)胞與對(duì)照組相較,紅色熒光強(qiáng)度較為微弱(P0.05)。與LPS組比較,LPS+PCA組細(xì)胞胞核內(nèi)紅色熒光明顯減少,熒光強(qiáng)度也明顯降低(P0.01),可見NF-κB的核轉(zhuǎn)運(yùn)明顯受到了抑制。4.PCA(1.25μg/ml)降低LPS作用的HUVEC中NF-κB p65、JUN和FOS的蛋白表達(dá)Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè),結(jié)果提示,與對(duì)照組相比,LPS組NF-κB p65、JUN和FOS的光密度比值均明顯增加(P0.01),而PCA組的比值無(wú)顯著變化。PCA+LPS組3種蛋白的比值則明顯低于LPS組(P0.01)。5.PCA(1.25μg/ml)降低LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TF基因、蛋白及細(xì)胞上清中TF的表達(dá)通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),LPS組TF的基因表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯增多(P0.01);而與空白對(duì)照組相比,PCA組的基因表達(dá)無(wú)明顯增加,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。LPS+PCA組與LPS組比較,TF的mRNA表達(dá)明顯減少,小于LPS組(P0.01)。TF蛋白檢測(cè)結(jié)果,與對(duì)照組相比,LPS組TF蛋白的光密度比值明顯增加(P0.01),而PCA組的比值無(wú)顯著變化。PCA+LPS組蛋白的比值則明顯低于LPS組(P0.01)。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TF表達(dá)量的結(jié)果,與對(duì)照組相比,LPS組TF的表達(dá)量明顯增加(P0.01),而PCA組的分泌量無(wú)顯著變化。PCA+LPS組TF的分泌量則明顯低于LPS組(P0.01)。結(jié)論:1、PCA對(duì)HUVEC結(jié)構(gòu)形態(tài)及生長(zhǎng)增殖性無(wú)明顯作用,但是能夠減輕LPS引起的VEC梭形化形態(tài)變化和細(xì)胞增長(zhǎng)活性的變化;2、PCA可通過(guò)NF-κB、AP-1途徑拮抗內(nèi)毒素對(duì)HUVEC的損傷作用,并通過(guò)這種作用抑制TF基因的表達(dá)以減少TF的分泌,可能是PCA來(lái)防治血栓性疾病的機(jī)制之一。
【圖文】：

皖南醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文結(jié) 果CA影響HUVEC形態(tài)結(jié)構(gòu)和增殖活性的結(jié)果倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察顯微鏡下直接觀察藥物作用后的細(xì)胞，，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組 HUVEC 呈現(xiàn)的是梭形，細(xì)胞邊界仍然清楚，胞質(zhì)飽滿，均勻呈鋪路石狀貼壁生長(zhǎng)（如圖照組比較，LPS 組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生梭形化，體積縮小，細(xì)胞排列不規(guī)則楚（圖 1B），PCA 組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。與 LPS 組比較，PCA+LP態(tài)改變明顯改善。

圖 2 PCA 對(duì) HUVEC 核的影響（X200）A:對(duì)照組，B:LPS 組，C:PCA(1.25μg/ml)組，D:PCA+LPS 組T 法測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果增殖活力通過(guò) MTT 法測(cè)定，由表 1、圖 3 可見，LPS 組的細(xì)胞 O比較下降顯著，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（IR）明顯增高，可見細(xì)胞活力）；PCA 組的 OD 值與對(duì)照組比較無(wú)明顯改變，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)）。PCA+LPS 實(shí)驗(yàn)組與 LPS 組比較，細(xì)胞 OD 值大于 LPS 組，IR細(xì)胞增殖活力上升明顯（P<0.05）。表 1 PCA 對(duì) HUVEC 活力的影響 ( x±s. n=5)LPS（μg/ml）PCA（μg/ml）OD 值 ol — — 0.554 0.051
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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9 張清;張玲玲;;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)及其相關(guān)研究[J];醫(yī)學(xué)綜述;2010年03期

10 劉們;劉映峰;徐琳;李公信;趙歡;張紫微;繆緋;;氧化低密度脂蛋白刺激內(nèi)皮細(xì)胞程序性死亡配體-1的表達(dá)[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2009年22期

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本文編號(hào)：2624164