【摘要】：目的:環(huán)孢素A(Cyclosporine A,CsA)是臨床上常用的一種強有效的免疫抑制劑,普遍用于免疫性疾病及人體器官移植術后。但隨著CsA的廣泛使用,其毒副作用也日漸明顯,包括對腎臟、肝臟在內的人體主要器官的毒性作用被相繼報道。然而臨床上器官移植術后,術者需服用相當長時間的高劑量的環(huán)孢素A以抵抗免疫排斥,這就為藥物毒性的出現提供了誘導條件。雖然臨床上患者服用CsA伴隨著血藥濃度的監(jiān)控,但只能通過降低CsA的用藥劑量來控制毒副作用的損害且對患者術后恢復及生活質量造成影響。本研究擬在代謝組學技術的支持下,探尋CsA肝腎毒性發(fā)生的體內生物標志物,發(fā)現CsA毒性作用產生的相關代謝路徑,并結合當前臨床患者配伍服用五味子類制劑前提條件及課題組前期五味子提取物的相關研究,闡明五味子醇提物對CsA肝腎毒性保護機制的機制,為CsA的合理應用提供參考依據。方法:1.五味子醇提物指紋圖譜的建立通過對比不同流動相系統(tǒng)、柱溫、流速和檢測波長下的色譜圖譜,優(yōu)化并確定色譜條件;運用中藥指紋色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對10批次五味子醇提物色譜圖進行相似度評價,建立五味子醇提物HPLC指紋圖譜。2.CsA誘導大鼠肝腎損傷的代謝組學研究根據臨床成人器官移植術后CsA維持的高劑量及時間,換算大鼠生物等效劑量為50 mg/kg·d~(-1),作用時間為7天。分別給予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA 1天、3天、7天,觀察對不同時間CsA作用下各組大鼠影響。檢測各組大鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉氨酶(AST)評價大鼠肝臟功能水平;檢測各組大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)評價大鼠腎臟功能水平。大鼠肝臟腎臟組織進行HE染色觀察組織病理損傷。收集各組大鼠犧牲前24h尿液,采用LC-MS/MS手段收集尿液中代謝離子信息,運用XCMS軟件對質譜數據進行分析,其中代謝物的鑒定和代謝通路分析基于數據庫KEGG(http://www.kegg.jp/)。3.五味子醇提物對CsA大鼠肝腎毒性保護作用機制研究在第二章研究基礎上,本章依據臨床高劑量維持時間增加CsA處理14天組別,用于驗證五味子醇提物對CsA肝腎毒性的影響。分別給予SD大鼠50 mg/kg·d~(-1) CsA及聯(lián)合給予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1) 3天、7天、14天,觀察對不同時間五味子醇提物對CsA大鼠的影響。檢測各組大鼠血清谷丙轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉氨酶(AST)用以評價大鼠肝臟功能水平;檢測各組大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)用以評價大鼠腎臟功能水平;大鼠肝臟腎臟組織進行HE染色觀察組織病理損傷;檢測肝腎組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)用以評價大鼠氧化應激水平;Western Blot檢測大鼠肝臟、腎臟4HNE、Nrf2、HO-1、NQO1、GCLM、Casepase-3、Bax、及Bcl-2表達水平,研究五味子醇提物保護CsA大鼠肝腎毒性作用的機制。結果:1.建立五味子醇提物HPLC指紋圖譜。10批次五味子醇提物液相色譜圖譜共標示了15個共有峰,并對其中四個共有峰進行了成分指認,分別是五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素,且10批次五味子醇提物的相似度均在0.942以上。2.CsA 50 mg/kg·d-1分別作用處理大鼠1天、3天、7天,傳統(tǒng)肝腎毒性損傷指標表明1天組大鼠肝臟功能指標(ALT、AST)和腎臟功能指標(CRE、BUN)未出現明顯改變,3天和7天組肝臟和腎臟功能指標出現顯著性差異變化;同時病理組織結果顯示:1天組肝腎組織未出現改變,而3天組可見明顯炎癥細胞浸潤,7天組可見明顯病理結構改變表明肝臟腎臟毒性的形成。收集各大鼠24h尿液,并運用LC-MS/MS對收集到的尿液進行代謝物分析。經過LC-MS/MS技術檢測,分析質譜下機數據共得到鑒定離子11555個。通過標準偏差分析(RSD≤30%)后共篩選出差異離子7657個,其中1天組3469個,包含2532個上調離子和937個下調離子;3天組3403個,包含2360個上調離子和1043個下調離子;7天組5393個,包含2283個上調離子和3110個下調離子。運用差異倍數分析及t檢驗分析并取3個實驗組與空白組對比后的數據交集,通過篩選三組共同存在的代謝產物,共得到697個代謝離子物。在697個鑒定的差異代謝物中,再通過KEGG富集分析及HMDB富集分析,15種代謝物被選為可能的代謝標志物,包括氨基天冬氨酸、尿酸、絲氨酸磷酸乙醇胺、D-4'-磷酸泛酸、二磷酸脫氧胞苷、脫氧尿苷二磷酸鹽、氨乙基磷酸鹽、二碘酪氨酸、二磷酸胞苷乙醇胺、腺苷酸琥珀酸、胞磷膽堿、脫氧腺苷三磷酸鹽、脫氧次黃苷三磷酸鹽、乙酰胞壁酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。15種代謝標志物涉及的代謝通路包括嘧啶代謝、嘌呤代謝、氨基酸代謝、甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝。3.為了驗證五味子醇提物對CsA大鼠肝腎毒性的影響,分別給予大鼠CsA 50 mg/kg·d~-11 3天、7天、14天,并在給與CsA的同時給予五味子醇提物216 mg/kg·d~(-1),其中單獨給予CsA組大鼠肝臟腎臟毒性改變隨時間的延長而加重,但同時給予CsA和五味子醇提物的大鼠肝腎毒性明顯減輕,表現在肝腎功能及病理方面。其中在14天組實驗中,在CsA能夠精準造成肝腎病理改變的情況下,五味子醇提物能夠明顯延緩肝腎組織病理發(fā)生改變。同時五味子醇提物能夠提高肝腎組織中MDA、SOD、CAT、GSH水平的改變。Western Blot結果顯示五味子醇提物能夠上調組織中Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM和Bcl-2的表達水平,下調組織中Casepase-3、Bax表達水平。結論:本研究成功建立五味子醇提物指紋圖譜,為五味子醇提物的提取方法及質量控制提供保證;用LC-MS/MS代謝組學技術方法,成功篩選出CsA誘導肝腎毒性的大鼠體內生物標志物,為CsA早期肝腎毒性的診斷提供了可靠依據;五味子醇提物對大鼠CsA誘導肝腎毒性的保護作用機制可能是激活Nrf2信號通路調控機體氧化應激和抑制組織細胞凋亡的發(fā)生來實現的。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2623657