發(fā)布時(shí)間：2020-04-11 13:05

【摘要】：研究背景及實(shí)驗(yàn)?zāi)康?根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,癌癥是全球第二大死因,2012年約有1400萬新發(fā)癌癥病例,2015年造成880萬例死亡,其中肝癌位居第二位(78.8萬例死亡)[1]。在中國,肝癌每年新發(fā)病例數(shù)為36.6萬人,每年死亡病例數(shù)為32.1萬,位居全國癌癥死亡第二位。肝癌約有80%-90%是原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),目前運(yùn)用于臨床的治療原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的方法主要有:手術(shù)切除及微創(chuàng)介入治療、放療、化療及生物細(xì)胞免疫療法、中醫(yī)藥等綜合治療。中醫(yī)藥在治療原發(fā)性肝癌中有巨大的發(fā)展空間,根據(jù)臨床觀察及報(bào)道,肝癌患者治療過程中配合中醫(yī)藥,可以延長生存期,提高生命質(zhì)量。而在中藥及其提取物中發(fā)現(xiàn)有效抗腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的成分并闡明其分子作用機(jī)制,成為新藥研發(fā)發(fā)展方向之一。漏蘆作為清熱解毒類中藥的代表藥物之一,在原發(fā)性肝癌的臨床中醫(yī)藥治療中,被廣泛應(yīng)用并取得相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)支持和部分實(shí)驗(yàn)支持;相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)表明,噻吩類化合物存在于漏蘆中,此類化合物能夠?qū)τ谀[瘤多藥耐藥有逆轉(zhuǎn)作用,并且對(duì)于腫瘤細(xì)胞的凋亡有誘導(dǎo),因此腫瘤的化療效果會(huì)提高。但對(duì)于其抗腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲的內(nèi)在分子作用機(jī)制仍為未明確。本課題組前期研究表明,flila-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚新生血管可以被漏蘆水提物所抑制,其作用機(jī)制與促進(jìn)TIE1的基因表達(dá)從而負(fù)反饋調(diào)節(jié)ANGPT-TIE信號(hào)通路相關(guān)[2]。肝細(xì)胞肝癌是一個(gè)涉及多基因、多位點(diǎn)、多通路改變的漸進(jìn)過程。PAK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,進(jìn)化保守,是Rho家族特別是小鳥苷三磷酸酶Cdc42,Rac和Rho下游重要的靶蛋白,可被細(xì)胞外信號(hào)活化,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及有絲分裂、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和血管生成等生物學(xué)功能,在腫瘤的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中可發(fā)揮重要作用。PAK4(p21-activated protein kinase 4)屬于PAK家族,在多種腫瘤中如乳腺癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、絨毛膜癌中高表達(dá)或異�；罨痆3-7]。本課題探討選用人肝癌細(xì)胞HepG2,采用漏蘆水提物處理該細(xì)胞,觀察HepG2細(xì)胞的生長情況,觀察HepG2細(xì)胞活力及增殖等情況,并結(jié)合相關(guān)基因組生物信息學(xué),進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,即RNA-seq,進(jìn)行分析數(shù)據(jù),分析相關(guān)基因的差異表達(dá),篩選出腫瘤相關(guān)基因PAK4,研究其內(nèi)在的分子機(jī)制,為漏蘆作為抗肝癌藥物提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:1.使用傳統(tǒng)煎煮藥物及干燥濃縮的方法,將漏蘆生藥3次煎煮后混合收膏并干燥打粉作為實(shí)驗(yàn)用藥。2.漏蘆水提物對(duì)HepG2的細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。分別以不同濃度的漏蘆水提物(1.00E+00,1.00E-01,1.00E-02,1.00E-03,1.00E-04,1.00E-05,1.00E-06,1.00E-07,8個(gè)工作濃度的漏蘆水提物培養(yǎng)基)處理HepG2細(xì)胞,采用Cell Titer-Glo細(xì)胞活力檢測(cè)法檢測(cè)漏蘆水提物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率,并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度IC50。3.基因的高通量分析RNA-seq:利用基因芯片法(RNA-seq)對(duì)漏蘆水提物處理后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),并分別計(jì)算基因水平和轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)差異情況,篩選出的樣品間或組間差異表達(dá)基因。4.以漏蘆水提物(0.29mg/ml,IC50)處理HepG2細(xì)胞72小時(shí),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)漏蘆水提物處理細(xì)胞后PAK4基因m RNA的表達(dá)量。5.以漏蘆水提物(0.29mg/ml,IC50)處理HepG2細(xì)胞72小時(shí),利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)漏蘆水提物處理細(xì)胞后PAK4基因蛋白的表達(dá)量。研究結(jié)果:1.漏蘆水提物組能夠抑制HepG2細(xì)胞活力,且隨藥物濃度增加而明顯增強(qiáng)(p0.01);測(cè)得72小時(shí)漏蘆水提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的半數(shù)抑制濃度IC50為0.29mg/ml。2.Cell Titer-Glo熒光細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)漏蘆水提物對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率,并繪制細(xì)胞生長曲線,顯示漏蘆水提物對(duì)HepG2細(xì)胞活力有抑制作用。3.高通量RNA-seq測(cè)序分析漏蘆水提物作用于HepG2細(xì)胞后基因差異表達(dá)水平,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄豐度計(jì)算后得出:對(duì)照組檢測(cè)到基因表達(dá)數(shù)為10726個(gè),轉(zhuǎn)錄本數(shù)目為23242個(gè);治療組(漏蘆水提物組)基因表達(dá)數(shù)為10922個(gè),轉(zhuǎn)錄本為23184個(gè)。4.高通量測(cè)序基因和轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá),PAK4基因表達(dá)差異顯著,log2(fold change)為-1.742405725,p-value為0.00037379。5.經(jīng)PAK4基因q RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,漏蘆水提物抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的活力機(jī)制與下調(diào)PAK4基因表達(dá)有關(guān)。結(jié)論:1.漏蘆水提物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞活力具有抑制作用;2.漏蘆水提物抑制人肝癌細(xì)胞HepG2活力的分子機(jī)制與下調(diào)PAK4基因的表達(dá)有關(guān)。
【圖文】：

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆碩士學(xué)火山圖（Volcano Plot）也是測(cè)序和芯片數(shù)據(jù)常用火山圖可以對(duì)不同樣本組間差異表達(dá)基因進(jìn)行圖形選得到差異表達(dá)基因[log2(FPKM Fold Change)]和篩并繪制火山圖，這樣可以直觀的展示基因在樣本組的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性之間的關(guān)系。通過篩選及評(píng)估，上82 個(gè)，，表達(dá)不顯著的基因有 10790 個(gè)，繪制火山圖

PAK4基因熒光定量PCR擴(kuò)增曲線
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李冬霞;王永玲;蔡松旺;;PAK4-LIMK1-Cofilin信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌遷移及侵襲能力的影響[J];中國病理生理雜志;2015年12期

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相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 李遠(yuǎn)志;野菊花、漏蘆水提物對(duì)斑馬魚COX2-MMPs及ANGPT-TIE信號(hào)通路調(diào)控作用的研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2016年

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 丁琛琛;microRNA-224參與調(diào)控肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：2623629