【摘要】：目的:中藥多糖是中藥復(fù)方主要成份之一,中藥多糖可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),基于多糖利用位點闡述參苓白術(shù)散多糖和理中湯多糖調(diào)節(jié)腸道擬桿菌生長的分子機制,為不同中藥復(fù)方多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的不同方式提供現(xiàn)代證據(jù)。方法:1、將兩株擬桿菌(多形擬桿菌、脆弱擬桿菌)、兩株厚壁菌(厚壁菌YT2、厚壁菌T30)分別選取擬桿菌、厚壁菌各一株混合,形成四個組合(多形擬桿菌和厚壁菌YT2、多形擬桿菌和厚壁菌T30、脆弱擬桿菌和厚壁菌YT2、脆弱擬桿菌和厚壁菌T30),分別在復(fù)合碳源BHI培養(yǎng)基、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上進行體外混合培養(yǎng),在不同時間段連續(xù)取樣,在不同中藥復(fù)方多糖作為細菌碳源,檢測不同組合中擬桿菌、厚壁菌的生長曲線,以獲得不同多糖碳源對混合菌的碳源競爭的影響作用。2、對自行分離的兩株厚壁菌(厚壁菌YT2、厚壁菌T30)采用第三代PacBio RSⅡ高通量測序平臺進行全基因測序。分別對兩株擬桿菌、兩株厚壁菌的全基因組序列進行多糖利用位點分析,從多糖利用位點角度解釋參苓白術(shù)散多糖和理中湯多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的微生態(tài)結(jié)構(gòu)的作用機制。同時對分解多糖能力較強的兩株擬桿菌進行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析。結(jié)果:1、四種不同組合的混合菌在不同碳源(BHI、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖)環(huán)境下進行體外培養(yǎng)。對于多形擬桿菌和厚壁菌YT2組合,分別在(BHI、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖)不同培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng),在32 h、44 h、24 h混合細菌最高峰總濃度分別為(31.97±0.67)×10~8 CFU/ml、(11.17±0.13)×10~8 CFU/ml、(8.64±0.26)×10~8 CFU/ml;對于多形擬桿菌和厚壁菌T30組合,分別在(BHI、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖)不同培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng),在36 h、32 h、36 h混合細菌最高峰總濃度分別為(24.90±0.88)×10~8 CFU/ml、(14.74±0.36)×10~8 CFU/ml、(18.37±1.00)×10~8 CFU/ml;對于脆弱擬桿菌和厚壁菌YT2組合,分別在(BHI、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖)不同培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng),在32 h、44 h、32 h混合細菌最高峰總濃度分別為(62.07±1.26)×10~8 CFU/ml、(32.66±1.63)×10~8 CFU/ml、(27.46±1.53)×10~8 CFU/ml;對脆弱擬桿菌和厚壁菌T30組合,分別在(BHI、參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖)不同培養(yǎng)基環(huán)境下培養(yǎng),在36 h、32 h、36 h混合細菌最高峰總濃度分別為(62.84±0.74)×10~8 CFU/ml、(37.22±1.39)×10~8 CFU/ml、(64.90±1.45)×10~8 CFU/ml。在參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖環(huán)境培養(yǎng)下:擬桿菌一直比厚壁菌生長更快;在BHI復(fù)合碳源環(huán)境培養(yǎng)下:厚壁菌生長前期快于擬桿菌,后期擬桿菌生長優(yōu)于厚壁菌,且兩種中藥復(fù)方多糖對四種不同組合的混合菌調(diào)節(jié)存在差異。2、厚壁菌T30全基因組序列大小為5288332 bp,GC含量為35.35%,編碼基因有5427個。厚壁菌T30具有2個基因簇,共識別了128個碳水化合物酶基因表達。厚壁菌YT2全基因組序列大小為3264034 bp,GC含量為28.76%,編碼基因有3098個。厚壁菌YT2具有1個基因簇,共識別了79個碳水化合物酶基因表達。將兩株擬桿菌與兩株厚壁菌全基因組碳水化合物進行對比,發(fā)現(xiàn)多形擬桿菌擁有大量碳水化合物基因,多形擬桿菌有88個多糖利用位點,可利用淀粉蛋白質(zhì)163種,多糖裂解酶15種以及糖苷水解酶226種;脆弱擬桿菌全基因組能夠編碼碳水化合物脂酶5種,多糖裂解酶3種,糖苷水解酶141種,糖苷轉(zhuǎn)移酶83種,其中預(yù)測全基因組中多糖利用位點31個。厚壁菌T30已全部進行預(yù)測出71個多糖利用位點基因簇,其中明確含有碳水化合物基因的多糖利用位點共有47條。厚壁菌T30全基因組能夠編碼碳水化合物脂酶6種,糖苷水解酶20種,糖苷轉(zhuǎn)移酶8種。厚壁菌YT2已全部進行預(yù)測出30個多糖利用位點基因簇,其中明確含有碳水化合物基因的多糖利用位點共有23條,其中夠編碼碳水化合物脂酶7種,糖苷水解酶14種,糖苷轉(zhuǎn)移酶11種。擬桿菌具有多種不同的多糖利用位點,分解多糖能力很強;厚壁菌相對擬桿菌碳水化合物基因極少,且缺乏多糖利用位點識別基因?qū)?分解多糖能力很弱,恰好與前文碳源競爭實驗結(jié)論相對應(yīng),在多糖環(huán)境下培養(yǎng),擬桿菌生長優(yōu)于厚壁菌可能與多糖利用位點的多少相關(guān)。對于兩株擬桿菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),多形擬桿菌在參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖環(huán)境培養(yǎng)下,被顯著表達的12個多糖利用位點中有10個多糖利用位點在理中湯多糖比參苓白術(shù)散多糖環(huán)境培養(yǎng)下更好的被表達出來;有2個多糖利用位點在參苓白術(shù)散多糖比理中湯多糖環(huán)境培養(yǎng)下更好的被表達出來。脆弱擬桿菌在參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖環(huán)境培養(yǎng)下,被顯著表達的13個多糖利用位點中有11個多糖利用位點在理中湯多糖比參苓白術(shù)散多糖環(huán)境培養(yǎng)下更好的被表達出來;有2個多糖利用位點在參苓白術(shù)散多糖比理中湯多糖環(huán)境培養(yǎng)下更好的被表達出來。結(jié)論:擬桿菌與厚壁菌的混合菌在參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng),擬桿菌生長明顯優(yōu)于厚壁菌,擬桿菌更具有碳源競爭優(yōu)勢,且兩種中藥復(fù)方多糖對四種混合菌調(diào)節(jié)存在差異;通過全基因組碳水化合物對比,擬桿菌擁有多糖利用位點明顯多于厚壁菌,擬桿菌分解多糖能力明顯強于厚壁菌,與碳源競爭實驗結(jié)論中擬桿菌更具有碳源競爭優(yōu)勢相符合,糖利用位點可能為參苓白術(shù)散、理中湯調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)機制之一。且通過擬桿菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)擬桿菌在參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖環(huán)境中多糖利用位點表達具有差異,以此證明,不同中藥多糖可誘導(dǎo)典型腸道擬桿菌多糖利用位點的差異表達,這可能是不同中藥復(fù)方以不同方式調(diào)節(jié)腸道擬桿菌的分子機制之一。
【圖文】：

將低聚糖向 SusC 轉(zhuǎn)運過程。多糖利用位點除了 SusC 和 SusD 蛋白，還包括其他外膜糖蛋白結(jié)合蛋白，編碼碳水化合物活性酶的基因(Carbohydrate-Active enZymes，，CAZYmes)、反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)運體，它們都有助于擬桿菌有效降解單個底物。其中利用位點降解何種多糖與碳水化合物活性酶基因表達功能上是相關(guān)的，但常被大片段未知功能基因區(qū)域分開，以便進行更好的調(diào)控[6]。

本實驗中混合菌的不同組合，其中所包括擬桿菌為革蘭氏陰性菌、厚壁菌為革蘭氏陽性菌，可以通過革蘭氏染色很好的區(qū)分，顯微鏡下算出每個固定視野中擬桿菌、厚壁菌的數(shù)量比。3.3 細菌數(shù)量換算結(jié)果通過計數(shù)多形擬桿菌、脆弱擬桿菌、厚壁菌 YT2、厚壁菌 T30 平板上的細菌個數(shù)轉(zhuǎn)換出 1 OD600所包含的細菌個數(shù)。其中 1 OD600多形擬桿菌有 49 × 108個細菌；1 OD60脆弱擬桿菌有 126 × 108個細菌；1 OD600厚壁菌 YT2 有 7.38 × 108個細菌；1 OD600厚壁菌 T30 有 2.35 × 108個細菌。3.4 參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖對擬桿菌和厚壁菌組合的競爭性結(jié)果3.4.1 參苓白術(shù)散多糖、理中湯多糖對多形擬桿菌和厚壁菌 YT2 競爭結(jié)果混合菌多形擬桿菌和厚壁菌 YT2 在不同碳源為培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)情況下，觀察擬桿菌、厚壁菌體外碳源競爭情況�；旌暇嘈螖M桿菌和厚壁菌 YT2 在 BHI 培養(yǎng)基中培
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2623302