銀翹散制劑主要成分綠原酸抗流感作用及其相關(guān)信號通路分子機制研究

發(fā)布時間：2020-04-11 07:14

【摘要】：目的:研究銀翹散制劑主要成分綠原酸抗流感作用及其相關(guān)細胞信號通路機制。方法:實驗一銀翹散制劑活性成分抗流感作用的研究1、銀翹散制劑活性成分的體內(nèi)抗流感作用初步篩選對小鼠流感病毒性肺炎作用的藥物。將雌性Balb/c小鼠采用區(qū)間分組法,將所有小鼠稱體重后,按照排列編上號,然后隨機分組。設(shè)空白對照組、病毒模型組、利巴韋林組(100mg/kg)、綠原酸、紫蘇醛、木犀草素、木犀草苷、薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元、葒草苷、牡荊素組各10只,藥量均為100mg/kg,0.5%吐溫-80助溶。各組均用適量的乙醚輕度麻醉,分別用流感病毒FM1株5LD50滴鼻感染,每鼠4-6滴,約0.05毫升。攻擊后2h開始給藥。共給藥6天,每日一次,按劑量灌胃給藥,0.1mL/10g,病毒模型組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液作為對照。通過小鼠體內(nèi)抗流感病毒藥物藥效測定方法,以感染病毒小鼠發(fā)病死亡為藥效指標,觀察上述中藥材對感染甲1型流感病毒的小鼠死亡率、體重變化的影響,初步篩選上述中藥材具有較好的抗流感病毒作用。2、基于細胞信號通路抗體芯片研究綠原酸抗流感作用機制在上述實驗的基礎(chǔ)上,選擇其中有效的中藥活性成分綠原酸,采用Full Moon公司的信號通路磷酸化抗體芯片和芯片配套試劑盒進一步研究其抗病毒療效及其作用的信號通路靶標。按照Full Moon公司的標準操作流程進行操作。樣品處理:A.樣品蛋白抽提;B.樣品蛋白標記;C.芯片檢測操作。實驗二基于細胞信號傳導機制研究綠原酸抗流感作用及其機制對小鼠體內(nèi)感染流感病毒的作用將120只雌性Balb/c小鼠采用區(qū)間分組法,將所有小鼠稱體重后,按照排列編上號,然后隨機分組。設(shè)正常對照組、病毒模型組、利巴韋林組(100mg/kg)、綠原酸高劑量(200mg/kg)、中劑量(100mg/kg)、低劑量(50mg/kg)組各20只。各組在乙醚輕度麻醉下分別以流感病毒FM1株5LD50滴鼻(i.n.,Intranasal)感染,每鼠5滴,約0.05毫升。攻擊后2h開始給藥。共給藥5天,每日一次,按劑量灌胃給藥,0.1mL/10g,正常對照組和病毒模型對照組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液作為對照。各組在感染病毒5天后從每組小鼠中隨機抽取10只測量取全肺組織觀察肺指數(shù)、觀察小鼠肺部病變,并分別進行肺干濕重、肺病理、采用ELISA法檢查肺組織炎癥因子TNF-α,IL-1β,IL-4,IFN-γ,蛋白免疫印跡(western-blot)技術(shù)檢測IKB α,NF-κ B P105流感病毒感染宿主細胞信號通路蛋白水平及抗病毒機制研究。其余10只繼續(xù)觀察感染后14天內(nèi)動物的死亡情況,計算死亡率、死亡保護率、平均存活天數(shù)和生命延長率。結(jié)果:1.銀翹散制劑活性成分抗流感病毒作用:研究表明綠原酸組的生存率高于其他小組的生存率,平均體重在第五第六天較其他藥物組下降緩慢,與病毒組相比,差別有統(tǒng)計學意義(K0.05);綠原酸組的肺指數(shù)低于其他各組,與利巴韋林組相比,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.CSP100抗體芯片結(jié)果:芯片上重復點的平均信號值越大結(jié)果越可靠。Fold change1.2 的有參考意義。結(jié)果表明,IKB-alpha、NF-κB p105、Src(Ab-529)和 PDK1(Ab-241)其對應(yīng)的 Fold changes 分別為:5.19、5.10、1.49 和 1.42 均大于 1.2。選擇Fold changes值較大的兩者IKB-alpha、NF-κB p105進行驗證。3.基于細胞信號通路綠原酸抗流感作用及其分子機制:結(jié)果表明,與病毒組相比,綠原酸高、低劑量組肺指數(shù)均有所降低,差別差別有統(tǒng)計學意義(P0.05。綠原酸各劑量組均能降低流感病毒感染小鼠的死亡率,延長流感病毒感染小鼠的平均生存時間,與病毒組相比較,差別差別有統(tǒng)計學意義(P0.05),表明綠原酸對流感病毒感染小鼠具有死亡保護作用。通過肺病理組織學檢測,綠原酸各劑量組均較病毒組有改善流感病毒感染小鼠肺部炎癥程度的作用。用Elisa方法測炎性細胞因子得出,綠原酸組高劑量組產(chǎn)生的IFN-高、IL-4含量增高,與病毒組相比,P0.05,差別有統(tǒng)計學差異;綠原酸組高劑量組的IL-1高和TNF-高水平顯著降低,與病毒組相比,P0.05,差別有統(tǒng)計學差異,表明綠原酸能夠抑制流感病毒小鼠病毒性肺炎的作用。最后,用Western blot檢測細胞通路相關(guān)蛋白指標,與病毒組相比,綠原酸三個劑量組IKB α綠蛋白表達水平顯著低于病毒組,與病毒組相比較,P0.05,差別差別有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:銀翹散制劑主要成分綠原酸對流感病毒感染小鼠具有一定的治療作用。綠原酸具有降低流感病毒感染鼠肺指數(shù),提高生命延長率,明顯改善肺炎病理,抑制肺組織炎癥細胞因子水平。綠原酸可以抑制肺組織IKB α以和NF-κB P105的蛋白表達水平,發(fā)揮其抗流感病毒作用。本研究為利用綠原酸開發(fā)安全有效抗流感病毒的藥物提供理論依據(jù)。
【圖文】：

銀翹散,制劑,活性成分,感病