【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD),是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,以進行性記憶力減退、認識功能障礙、執(zhí)行能力障礙、失語、失用、視空間障礙以及精神行為異常為主要臨床特征。隨著世界人口老齡化程度的不斷加劇,AD的發(fā)病率逐年升高,在老年人群中AD已成為繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第4位致死原因,給社會和家庭帶來了沉重的負擔。AD的發(fā)病機制復雜,至今尚未明確,目前存在的假說包括β淀粉樣蛋白毒性學說、Tau蛋白代謝異常學說、基因突變學說、膽堿能缺乏學說、興奮性氨基酸毒性學說、神經(jīng)炎癥學說、鈣超載學說、代謝綜合征學說等。因其發(fā)病機制復雜,AD仍缺乏有效的治療手段。目前經(jīng)FDA批準用于治療AD的藥物只有多奈哌齊和美金剛,然而這兩種藥物只能改變神經(jīng)遞質(zhì)水平,不能改變AD的病理過程、阻止AD的病情進展,因此對AD的治療仍是世界范圍內(nèi)醫(yī)學研究者所面臨的挑戰(zhàn)之一。研究證實AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞在Aβ刺激下激活,被長期、慢性活化,進而合成和釋放大量炎癥介質(zhì),最終造成神經(jīng)元的損傷和丟失。存在于小膠質(zhì)細胞中的NF-κB作為多效性的核轉(zhuǎn)錄因子,能夠調(diào)控多種炎癥因子的信號轉(zhuǎn)導,其中一條重要的炎癥信號通路就是NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β。NF-κB被激活后轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi),一方面誘導IL-1β基因表達,產(chǎn)生大量無活性的IL-1β前體(pro-IL-1β),另一方面誘導NLRP3表達。NLRP3在外界損傷刺激下,募集接頭蛋白ASC和效應蛋白caspase-1組成NLRP3炎癥體,后者會將pro-IL-1β剪切為有強烈促炎活性的IL-1β,進而誘導其他炎癥因子、趨化因子等的合成,導致腦內(nèi)的炎癥級聯(lián)反應。目前已有多項研究證實,抑制NLRP3炎癥體可以減少Aβ的沉積,改善認知功能。因此,NLRP3炎癥小體成為了目前AD防治研究領(lǐng)域的熱點。臨床流行病研究究顯示,長期服用非甾體抗炎藥物(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)的患者AD的發(fā)病率明顯減低。這一現(xiàn)象提示我們:以調(diào)控神經(jīng)炎癥為靶點來治療AD,可能會獲得良好的治療效果。然而,目前已開展的針對NSAIDs治療AD的數(shù)項臨床試驗大多因藥物的胃腸道副作用而中止,從而限制了抗炎療法在AD治療領(lǐng)域中的探索性研究。中醫(yī)藥是中華民族的偉大瑰寶之一,以其低毒、調(diào)節(jié)全身機體功能的整體觀,以及多靶點、多環(huán)節(jié)的作用特點,在眾多疾病的防治中起到了良好的效果。基于對癡呆的中醫(yī)病機的理解和閱讀經(jīng)典中醫(yī)古籍,結(jié)合前期的研究成果,我們在古代經(jīng)方“不忘散”基礎(chǔ)上,根據(jù)單味中藥之間的有機配伍和協(xié)同作用,構(gòu)建了由遠志、石菖蒲、人參、茯苓、茯神、當歸、白術(shù)和黃連組成的“加味不忘散”。該組方更加合理全面,既扶正又祛邪,切中、兼顧了 AD的主要病機。目前已應用于臨床,收到了較好的效果。在前期研究基礎(chǔ)上,本研究以神經(jīng)免疫炎癥學說為根據(jù),以信號轉(zhuǎn)導通路途徑為切入點,從體內(nèi)實驗和體外實驗兩個層次,驗證加味不忘散治療AD的有效性,并進一步觀察該組方對AD神經(jīng)炎癥的影響。第一部分加味不忘散對AD模型大鼠學習記憶功能及海馬組織結(jié)構(gòu)的影響目的:1.觀察加味不忘散對AD模型大鼠學習記憶功能影響;2.觀察加味不忘散對AD模型大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元凋亡的影響。方法:1.將SD大鼠分為假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低劑量干預組、加味不忘散中劑量干預組、加味不忘散高劑量干預組和MCC950干預組;2.通過腦立體定位技術(shù)向雙側(cè)海馬注射Aβ1-42制備AD大鼠模型;3.運用Morris 水迷宮試驗評估大鼠學習記憶功能;4.大腦切片進行HE染色,在光鏡下觀察大鼠海馬的組織結(jié)構(gòu);5.利用透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化,并計數(shù)突觸數(shù)量進行比較;6.運用TUNEL染色法觀察海馬神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果:1.加味不忘散對AD模型大鼠學習記憶試驗的影響:假手術(shù)組大鼠第1天到第5天的逃避潛伏期分別為 69.79±13.54 s、52.16±3.87 s、34.75±17.10 s、19.71±5.39 s、10.57±3.85 s。AD模型組大鼠第1天到第5天的逃避潛伏期分別為79.21±16.37s、74.46±5.58s、65.00±8.62s、41.82±8.87s、28.96±6.73s,與假手術(shù)組相比,在第 2-5 天的逃避潛伏期均明顯延長(P0.01)。加味不忘散低劑量干預組大鼠第1天到第5天的逃避潛伏期分別為 77.96±13.83 s、75.78±7.92 s、62.91±7.99 s、38.82±10.93 s、25.75±6.77 s,與AD模型組相比無顯著差異(p0.05)。加味不忘散中劑量干預組大鼠第1天到第 5 天的逃避潛伏期分別為 76.21±12.80s、64.28±8.37s、50.87±8.61s、30.82±5.33s、19.82±2.68 s,第2-5天的逃避潛伏期較AD模型組和加味不忘散低劑量干預組明顯縮短(p0.05)。加味不忘散高劑量干預組大鼠第1天到第5天的逃避潛伏期分別為70.42±14.08s、54.74±10.40s、38.07±8.31s、22.59±5.42s、14.39±3.51s,第 2-5 天的逃避潛伏期較AD模型組和加味不忘散低劑量干預組明顯縮短(p0.01),較加味不忘散中劑量干預組也縮短(P0.01)。MCC950干預組大鼠第1天到第5天的逃避潛伏期分別為 71.65±16.03s、54.51±10.01s、39.36±7.14s、22.24±5.11s、13.93±3.68s,第 2-5天的逃避潛伏期較AD模型組和加味不忘散低劑量干預組明顯縮短(p0.01),較加味不忘散中劑量干預組也縮短(P0.01),與加味不忘散高劑量干預組相比無顯著差異(P值分別為 0.938、0.815、0.928、0.857)。2.加味不忘散對AD模型大鼠空間探索能力的影響:假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠的原平臺象限停留時間分別為41.14±4.22s、23.28±8.34s、24.57±7.33s、31.71±6.97s、39.43±5.44s、39.15±4.06s。其中AD模型組大鼠的原平臺象限停留時間明顯短于假手術(shù)組(p0.001),加味不忘散低劑量干預組大鼠的原平臺象限停留時間也明顯短于假手術(shù)組(P0.001),與AD模型組無明顯差異(p=0.703)。加味不忘散中劑量組大鼠的原平臺象限停留時間較AD模型組(P = 0.016)和加味不忘散低劑量干預組(p = 0.040)均有所延長。加味不忘散高劑量組大鼠的原平臺象限停留時間較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p = 0.027)均延長。MCC950干預組大鼠的原平臺象限停留時間較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p = 0.033)均延長,與加味不忘散高劑量組相比無統(tǒng)計學差異(p= 0.933)。假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠的跨臺次數(shù)分別為 12.71±2.63、5.29±1.38、7.43±1.62、9.71±1.50、12.14±2.41、12.29±3.39。其中AD模型組大鼠的跨臺次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(p0.001),加味不忘散低劑量干預組大鼠的跨臺次數(shù)也明顯少于假手術(shù)組(p0.001),與AD模型組無明顯差異(p = 0.056)。加味不忘散中劑量組大鼠的跨臺次數(shù)較AD模型組(p0.001)和加味不忘散低劑量干預組(p = 0.042)均增多。加味不忘散高劑量組大鼠的跨臺次數(shù)較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p=0.031)均增多。MCC950干預組大鼠的跨臺次數(shù)較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p = 0.023)均顯著增多,與加味不忘散高劑量組相比無統(tǒng)計學差異(p = 0.895)。3.加味不忘散對AD模型大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)的影響:HE染色顯示,AD模型組和加味不忘散低劑量組海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,細胞體積縮小,核固縮,排列紊亂;加味不忘散中、高劑量干預組和MCC950大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量明顯增多、排列變整齊、異常細胞減少。4.加味不忘散對AD模型大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的影響:通過透射電鏡觀察到,AD模型組大鼠海馬大量神經(jīng)元變性、壞死,核固縮,線粒體腫脹明顯。與AD模型組相比,隨著加味不忘散干預劑量的增加,大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)逐漸變完整,變性或壞死的神經(jīng)元逐漸減少,細胞漿內(nèi)細胞器數(shù)量逐漸增多、形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為正常。5.加味不忘散對AD模型大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響:通過透射電鏡觀察海馬突觸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),AD模型組大鼠海馬內(nèi)的突觸結(jié)構(gòu)被破壞,突觸結(jié)構(gòu)不完整,突觸間隙增大,突觸后膜內(nèi)的致密物質(zhì)變薄。與AD模型組相比,隨著加味不忘散干預劑量的增加,海馬內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)逐漸由不完整變完整,突觸間隙由大變小,突觸后膜內(nèi)的致密物也由少變多。假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠海馬的突觸數(shù)量分別為 27.31±6.99、10.76±3.19、13.64±3.53、19.61±3.69、25.77±7.21、24.93±5.97。其中AD模型組大鼠海馬的突觸數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少(p0.001),加味不忘散低劑量干預組大鼠海馬的突觸數(shù)量也明顯少于假手術(shù)組(P0.001),與AD模型組無明顯差異(p = 0.248)。加味不忘散中劑量組大鼠海馬的突觸數(shù)量較AD模型組(p = 0.001)和加味不忘散低劑量干預組(p = 0.015)均增多。加味不忘散高劑量組大鼠海馬的突觸數(shù)量較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p = 0.013)均增多。MCC950干預組大鼠海馬的突觸數(shù)量較AD模型組(P0.001)、加味不忘散低劑量干預組(P0.001)和加味不忘散中劑量干預組(p= 0.031)均顯著增多,與加味不忘散高劑量組相比無統(tǒng)計學差異(p = 0.709)�？梢�,加味不忘散對AD模型大鼠突觸結(jié)構(gòu)和數(shù)量具有改善作用,并具有劑量依賴性。6.加味不忘散對AD模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響:TUNEL染色顯示,假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠海馬的細胞凋亡率分別為 5.50±2.13%、38.06±12.87%、31.33±11.57%、22.71±7.55%、16.43±4.25%、14.38±5.28%。AD模型組可見到大量凋亡細胞,與假手術(shù)組相比明顯增多(p0.001)。加味不忘散低劑量干預組大鼠海馬內(nèi)也可見到大量凋亡細胞與AD模型組無明顯差異(p = 0.623)。加味不忘散中劑量干預組大鼠海馬凋亡細胞,較AD模型組明顯減少(p0.001),較加味不忘散低劑量干預組有減少趨勢,但無顯著性差異(p = 0.058)。加味不忘散高劑量干預組大鼠海馬的凋亡細胞明顯少于較AD模型組(p0.001)、加味不忘散低劑量干預組(p0.001)和中劑量干預組(p = 0.16)。MCC950干預組大鼠海馬的凋亡細胞數(shù)較AD模型組明顯減少(p0.001),與加味不忘散高劑量干預組相比無顯著差異(P = 0.907)。結(jié)論:1.加味不忘散有利于AD模型大鼠學習記憶能力的改善。2.加味不忘散有利于減輕AD模型大鼠海馬組織的病理損害。第二部分加味不忘散對AD模型大鼠海馬內(nèi)炎癥反應的影響目的:1.觀察加味不忘散對AD模型大鼠海馬炎癥反應的影響。2.觀察加味不忘散對AD模型大鼠海馬NF-κB-NLPR3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路的影響。方法:1.應用ELISA技術(shù)檢測大鼠血清和海馬內(nèi)炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。2.應用 qRT-PCR 技術(shù)檢測海馬內(nèi) NF-κB、NLPR3、caspase-1 和 IL-1βmRNA 的水平。3.應用免疫組化技術(shù)和western blot技術(shù)檢測海馬細胞內(nèi)NF-κB、NLPR3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平。結(jié)果:1.加味不忘散對AD模型大鼠腦內(nèi)炎癥反應的影響:通過ELISA檢測顯示,假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α比較均未見顯著性差異,p值分別為0.286、0.414和0.394。假手術(shù)組、AD模型組、加味不忘散低、中、高劑量干預組和MCC950干預組大鼠海馬中的 IL-1β 分別為 27.88±4.64 pg/mL、48.75±3.01 pg/mL、45.63±3.29 pg/mL、42.13±4.50pg/mL、38.88±4.02pg/mL、34.88±1.25;海馬中 IL-6 水平分別為 29.38±8.07 pg/mL、57.12±6.08pg/mL、53.50±7.73pg/mL、47.13±5.06pg/mL、40.25±4.46pg/mL、39.25±3.92pg/mL;海馬中 TNF-α 的水平分別為 32.63±3.62pg/mL、57.88±6.56pg/mL、54.25±4.06pg/mL、49.88±3.80pg/mL、43.00±7.27pg/mL、46.63±6.14pg/mL。統(tǒng)計學分析顯示,加味不忘散中劑量和高劑量干預組大鼠海馬內(nèi)的IL-1β、IL-6和TNF-α均明顯低于AD模型組(p0.05)。而各組大鼠海馬內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α的水平隨著加味不忘散劑量的增高而呈下降趨勢。2.加味不忘散對NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路的影響:qRT-PCT、westernblot和免疫組化檢測結(jié)果顯示,在AD模型組,NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β 炎癥通路被激活,NF-κB、NLRP3、caspase-1 和 IL-1β 的轉(zhuǎn)錄和表達水平較假手術(shù)組明顯增高(p0.01)。加味不忘散低劑量組大鼠海馬內(nèi)NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和表達水平較AD模型組無明顯差異(p0.05)。高劑量的加味不忘散可以明顯抑制NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路,與AD模型組相比NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和表達水平均明顯下降(p0.01)。而在加味不忘散低、中、高劑量三組之間,隨著藥物干預劑量的增高,NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的轉(zhuǎn)錄和表達水平逐漸下降。結(jié)論:加味不忘散可抑制AD大鼠模型腦內(nèi)的NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路,有利于降低神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元凋亡水平。第三部分加味不忘散對BV-2細胞炎癥反應的抑制作用以及對NF-KB-NLRP3 炎癥體-caspase-1-IL-1β通路的影響目的:1.觀察加味不忘散對Aβ1-42誘導的BV-2細胞炎癥反應的影響;2.觀察加味不忘散對BV-2細胞內(nèi)NF-κB-NLPR3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路的影響。方法:1.將BV-2細胞分為正常對照組、Aβ處理組、加味不忘散低劑量干預組、加味不忘散中劑量干預組、加味不忘散高劑量干預組和MCC950干預組;2.運用Aβ1-42刺激BV-2細胞,在體外條件下模擬AD的小膠質(zhì)細胞激活過程;3.制備加味不忘散大鼠含藥血清,根據(jù)不同分組進行細胞培養(yǎng);4.應用ELISA技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液中炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;5.應用Transwell共培養(yǎng)技術(shù),將BV-2細胞與SH-SY5Y細胞共培養(yǎng),通過流式細胞術(shù)檢測SH-SY5Y細胞凋亡情況;6.運用 westernblot 檢測 BV-2 細胞內(nèi) NF-κB、NLPR3、caspase-1 和 IL-1β 的蛋白水平;7.應用免疫熒光技術(shù)觀察BV-2細胞內(nèi)NF-κB和NLRP3炎癥體的活化情況,以及IL-1β的釋放情況。結(jié)果:1.加味不忘散對BV-2細胞活化的影響:通過免疫熒光觀察BV-2細胞的形態(tài),Aβ處理組BV-2細胞被激活,細胞圓大,分支減少,聚集成簇,而使用加味不忘散含藥血清培養(yǎng)BV-2細胞,隨著藥物劑量的增加,BV-2細胞胞體逐漸由大變小,分支增多,聚集成簇現(xiàn)象減少。2.加味不忘散對BV-2細胞炎癥介質(zhì)的影響:通過ELISA檢測顯示,正常對照組、Aβ處理組、加味不忘散低劑量干預組、加味不忘散中劑量干預組、加味不忘散高劑量干預組和MCC950干預組BV-2細胞培養(yǎng)液中IL-1β的水平分別為21.74±7.23 pg/mL、58.54±6.84pg/mL、51.58±4.35pg/mL、41.41±4.43pg/mL、33.67±6.70pg/mL、32.63±4.44pg/mL;IL-6 的水平分別為 20.26±4.29pg/mL、47.04±6.99pg/mL、41.67±4.09 pg/mL、33.27±4.74pg/mL、27.41±4.12pg/mL、29.40±6.95pg/mL;TNF-α 的水平分別為35.11±10.26pg/mL、89.26±11.88pg/mL、81.49±5.37pg/mL、70.09±12.01pg/mL、53.57±8.35pg/mL、54.37±9.55pg/mL。統(tǒng)計學分析顯示,Aβ處理組BV-2細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平最高,明顯高于正常對照組(p0.001)。加味不忘散中、高劑量干預組BV-2細胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平均明顯低于Aβ處理組(p0.05),而且隨著加味不忘散干預劑量的增加,IL-1β、IL-6和TNF-α的水平呈逐漸下降趨勢。3.加味不忘散對神經(jīng)元細胞的保護作用:應用流式細胞術(shù)檢測Transwell共培養(yǎng)體系中SH-SY5Y細胞的凋亡率顯示,正常對照組、Aβ處理組、加味不忘散低劑量干預組、加味不忘散中劑量干預組、加味不忘散高劑量干預組和MCC950干預組中SH-SY5Y 細胞的總凋亡率分別為 5.42±0.76%、27.37±2.23%、24.79±5.65%、18.14±4.54%、11.41±3.58%和10.86±2.81%。Aβ處理組SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯高于正常對照組(p0.001),與加味不忘散低劑量干預組相比無明顯差異(p = 0.989)。在加味不忘散中劑量和高劑量干預組,SH-SY5Y細胞的細胞總凋亡率均明顯低于Aβ處理組(p0.001)。加味不忘散低、中、高劑量干預組SH-SY5Y細胞的細胞總凋亡率相比,隨著藥物濃度的升高,細胞總凋亡率逐漸下降。4.加味不忘散對BV-2細胞內(nèi)NF-κB-NLRP3炎癥體-caspase-1-IL-1β炎癥通路的影響:western blot發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,Aβ處理組BV-2細胞內(nèi)NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平明顯增高(p0.001)。與Aβ處理組相比,加味不忘散低劑量干預組內(nèi)NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β的水平未見明顯降低(p0.05)。加味不忘散中、高劑量干預組BV-2細胞內(nèi)NF-κB、NLRP3、caspase-1和IL-1β水平較Aβ處理組明顯下降(p0.01),且具有劑量依賴性。通過免疫熒光觀察顯示,Aβ處理組BV-2細胞內(nèi)可見到大量活化的NF-κB和NLRP3炎癥體,釋放大量IL-1β;而在使用加味不忘散干預后,隨著藥物劑量的增加,活化的NF-κB和NLRP3炎癥體逐漸減少,IL-1β的釋放也逐漸減少。結(jié)論:加味不忘散可以以小膠質(zhì)細胞為靶點,抑制小膠質(zhì)細胞內(nèi)NF-κB和NLRP3炎癥體的活化,減少IL-1β的釋放,進而抑制小膠質(zhì)細胞所介導的神經(jīng)炎癥反應,有助于神經(jīng)元的保護。
【圖文】：

山西醫(yī)科大學博士學位論文2 結(jié) 果2.1 各組大鼠總體狀況所有 240 只大鼠總體生長狀況良好，大鼠體重以每周 5-7 g 的速度增長。如圖 1-1 所示，雙側(cè)海馬定向注射操作順利，無明顯操作相關(guān)并發(fā)癥。假手術(shù)組大鼠活動情況、進食、飲水情況無明顯變化。在造模后，模型組大鼠活動明顯減少，反應遲鈍，進食量無明顯變化。加味不忘散低、中、高劑量干預組大鼠在術(shù)后第一周活動少，反應遲鈍，進食量、飲水量減少，后進食量、飲水量逐漸恢復，加味不忘散中、高劑量干預組、MCC950 干預組反應活動逐漸變活躍。

132.2.1 定位航行試驗如圖 1-3 所示，在 5 天的定位航行試驗中，，各組大鼠的逃避潛伏期隨著訓練天數(shù)的增長而逐漸縮短，說明跨上平臺是一個學習記憶過程，同時各組大鼠在經(jīng)過訓練后學習記憶能力均有所提高。圖 1-2 Morris 水迷宮試驗A：Morris 水迷宮；B：Morris 水迷宮圖像采集分析系統(tǒng)；C-E：定位航行試驗（大鼠游泳及跨上平臺）
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5;R-332


本文編號：2622296