【摘要】：目的:鮑曼不動桿菌近年來呈世界性流行趨勢,已成為我國院內(nèi)感染最重要的病原菌之一,尤其是廣泛耐藥鮑曼不動桿菌(Extensively drug resistant Acinetobacter baumannii,XDRAB),耐藥性的快速傳播和多重的耐藥機制給臨床治療帶來極大的困難,開發(fā)新型抗生素迫在眉睫。中藥在中國感染性疾病的治療中有著長期的應(yīng)用,積累了豐富的經(jīng)驗,從清熱解毒中藥中尋找抗菌藥效物質(zhì)被認為是一條有效路徑。線蟲感染模型具有高通量、能全面反映藥物體內(nèi)活性等諸多優(yōu)點,是抗菌藥物篩選的理想實驗模型。課題組前期研究初步建立了XDRAB-線蟲感染模型,并將其用于抗菌活性中藥的篩選,然而該模型尚不完善、篩選中藥范圍不夠廣泛。因此,本研究擬通過優(yōu)化線蟲感染模型的各項條件,提升模型的可靠性和穩(wěn)定性;并基于該模型對多種清熱解毒中藥的抗菌活性進行評價,以發(fā)現(xiàn)具有體內(nèi)抗菌活性的中藥;在此基礎(chǔ)上,進一步對活性中藥主要成分的體內(nèi)外抗菌活性進行評價,為研究和開發(fā)新型、高效的抗菌藥物提供科學依據(jù)。方法:1.選用glp-4;sek-1雙基因突變線蟲,構(gòu)建用于體內(nèi)活性評價的XDRAB-C.elegans感染模型,通過觀察線蟲的存活率和生存狀態(tài),不斷優(yōu)化培養(yǎng)基組成、XDRAB的感染濃度、感染時長和藥物的最佳干預時長等條件;2.2.1藥材提取選取2010版《中國藥典》一部中具清熱解毒功效的73味中藥,分別用水、50%乙醇、95%乙醇三種不同的溶劑,按1:10的物料比,通過回流提取的方法得到三種提取物,每次1小時,提取兩次合并濾液后,在水浴鍋上水浴干燥得到浸膏,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?.2活性評價將中藥不同提取物稀釋成五個梯度濃度(1000μg/mL、100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL),作用于感染模型,根據(jù)線蟲存活率評價其體內(nèi)抗菌活性。3.對篩選得到的具較好體內(nèi)抗菌活性的提取物,采用線蟲感染模型和微量肉湯稀釋法,從多方面分析比較其主要成分的體內(nèi)外抗菌活性。結(jié)果:1.在構(gòu)建模型時,不同濃度的XDRAB和Fe~(3+)對線蟲的致死情況不同,選擇5×10~6 CFU/mL的XDRAB并加入10μmol的Fe~(3+)到20%BHI液體培養(yǎng)基中作為線蟲感染的濃度。線蟲生存實驗顯示,XDRAB感染線蟲3 h后線蟲組與加入多粘菌素B的對照組生存曲線比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ~2=3.154,P0.05),感染線蟲6、9 h,與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(均P0.001),但感染6 h與9 h組的生存曲線比較,差異無統(tǒng)計學意義(χ~2=0.669,P0.05),最終選擇6h作為感染時長,36 h為合適的抗菌藥物治療時長。2.通過XDRAB-C.elegans模型對73味清熱解毒中藥提取物的體內(nèi)抗菌活性進行評價,從中篩選得到具有顯著體內(nèi)抗菌活性的中藥牡丹皮。3.對牡丹皮的四種主要活性成分丹皮酚、芍藥苷、白樺脂酸、沒食子酸的體內(nèi)外抗菌活性進行評價,結(jié)果表明丹皮酚可以顯著提升XDRAB感染線蟲的生存率且無明顯毒性作用;丹皮酚對XDRAB的MIC值為1024μg/mL,芍藥苷的MIC值為2048μg/mL,沒食子酸和白樺脂酸無抗XDRAB活性。結(jié)論:本研究通過進一步優(yōu)化XDRAB-C.elegans感染模型,從73味清熱解毒類中藥中篩選出了具有顯著體內(nèi)抗菌活性的中藥牡丹皮,并驗證得到其主要活性成分丹皮酚在體內(nèi)外均有明顯抗XDRAB活性,為研究和開發(fā)新型、高效的抗菌藥物提供科學依據(jù)。
【圖文】：

- - - - - - - - - + + + 表示 XDRAB GZ-JZH-1;ATCC-25922 表示 E. coli ATCC25922“-”表示試管澄清透明，無菌。C. elegans 感染模型的優(yōu)化培養(yǎng)基及 XDRAB 濃度對線蟲感染模型的影響度的 XDRAB（5×108、5×107、5×106、5×105CFU/mL，的液體培養(yǎng)基（10 % BHI、20 % BHI）中感染秀麗隱態(tài)，確定合適的感染條件。在液體培養(yǎng)基中，存活線肉不停泵動，在光線和機械刺激時可以自由活動，而直線型僵直狀態(tài)，有些身體過于腫脹而使得陰戶突出線蟲明顯喪失身體結(jié)構(gòu)（圖 2-1），死線蟲和活性具有定量計算。

RAB 對線蟲的感染影響，當加入 10 μM 的 Fe3＋后，，比不加 Fe3＋有對線蟲的感明顯的提高，但增加 Fe3＋濃度對線蟲感染沒有明顯差異性，同時為了節(jié)省原最終選擇加入 10μM Fe3＋進入 20 % BHI 液體培養(yǎng)基中增加 XDRAB 對線蟲的力。通過考察不同濃度的 XDRAB 感染線蟲的情況（圖 2-3），發(fā)現(xiàn)在不同濃度RAB 感染下的半數(shù)致死時長（Time for half to die，LT50）明顯不同，5×10/mL XDRAB 感染時 LT50為 12 h，5×107CFU/mL XDRAB 感染時 LT50為 18 h06CFU/mL XDRAB 感染時 LT50為 30h，在 5×105CFU/mL XDRAB 感染時 LT52 h。根據(jù)不同濃度 XDRAB 的致病力以及不同濃度 XDRAB 對試驗進度的影模型最終選取 5×106CFU/mL XDRAB 作為感染濃度。在優(yōu)化感染模型的過程中，以上感染條件有時候并不能重現(xiàn)，線蟲有時還是感染致死。通過分析失敗原因，我們推測是未充分清洗干凈的 E. coli OP5曼相互作用干擾了鮑曼對線蟲的感染，因此我們加入了最小抑菌濃度為 mL 的萘啶酸以抑制 E. coli OP50 的生長，得到了很好的效果，感染成功率幾乎00 %。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285

【參考文獻】

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本文編號：2622041