發(fā)布時(shí)間：2020-04-10 08:47

【摘要】：Wilson’s病(WD)是一種由ATP7B基因突變引起的常染色體隱性遺傳病,該基因突變可引起銅代謝障礙,導(dǎo)致銅在肝臟,腦等組織異常沉積,臨床主要表現(xiàn)為肝硬化,神經(jīng)/精神癥狀,運(yùn)動(dòng)障礙等。影像學(xué)研究提示腦型患者病變主要位于基底神經(jīng)節(jié),實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)高銅可損傷小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元,這些證據(jù)提示高銅誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷是WD患者腦損傷的重要機(jī)制。因此,研究高銅誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷機(jī)制及其可能的干預(yù)途徑,是腦型WD患者治療學(xué)研究的一個(gè)重要科學(xué)問題。銅在細(xì)胞內(nèi)的大量蓄積可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng),增加活性氧(ROS)的釋放,ROS在細(xì)胞內(nèi)聚集可通過多途徑誘導(dǎo)自噬發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),銅-多巴胺絡(luò)合物也可誘導(dǎo)大鼠多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生線粒體自噬。WD以金屬絡(luò)合劑為主的治療方法因其毒副反應(yīng)使許多患者不能耐受,嚴(yán)重影響了本病患者的病情和預(yù)后。本課題單位以清熱解毒、通腑利濕治法治療WD患者獲得顯著療效,在此基礎(chǔ)上加用活血養(yǎng)髓藥物,以“通腑養(yǎng)髓”法治療腦型WD患者,臨床癥狀明顯改善。前期研究發(fā)現(xiàn)通腑養(yǎng)髓方可下調(diào)TX小鼠腦內(nèi)ASM、Cer、NK等蛋白的表達(dá),從而改善TX小鼠的腦損傷癥狀。但這些研究尚不能完全闡明通腑養(yǎng)髓方對(duì)高銅誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的具體療效機(jī)制。高銅可誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬性死亡,因此我們假設(shè)通腑養(yǎng)髓方通過調(diào)控多巴胺能神經(jīng)元自噬相關(guān)通路阻斷高銅誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用,改善WD患者腦損傷癥狀。目的:研究通腑養(yǎng)髓方對(duì)高銅誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬效應(yīng)及其作用機(jī)制,為中醫(yī)藥防治腦型WD提供新的治療靶點(diǎn)和研究思路。方法:(1)采用MTT法檢測(cè)不同劑量CuSO_4作用SH-SY5Y細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞存活率影響,篩選CuSO_4造模濃度及時(shí)間,模擬WD的細(xì)胞模型。(2)采用原子吸收法檢測(cè)含通腑養(yǎng)髓方兔血清,及丁苯酞兔血清作用不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn),對(duì)模型SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響,篩選含藥血清作用濃度及作用時(shí)間。(3)采用乳酸脫氫酶LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞LDH漏出率。(4)采用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。(5)采用熒光染料JC-1檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位。(6)采用AO/EB染色法觀察細(xì)胞內(nèi)自噬空泡形成情況。(7)采用電鏡法觀察自噬體的形成。(8)采用MDC染色法對(duì)自噬進(jìn)行定量分析。(9)采用Western Blot法檢測(cè)Cyt-c的表達(dá)。(10)采用Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、mTOR、P27、ULK1、p-ULK的表達(dá)。(11)采用Real-time PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因LKB1、AMPK、TSC2、mTOR、P27、ULK1的表達(dá)。結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示:CuSO_4對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷呈現(xiàn)一定的量效和時(shí)效關(guān)系(P0.01)。隨著CuSO_4作用劑量及時(shí)間的增加,SH-SY5Y細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P0.01)。(2)MTT結(jié)果顯示:與模型組對(duì)比,10%的含通腑養(yǎng)髓方兔血清及含丁苯酞兔血清可顯著抑制CuSO_4誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(P0.01)。(3)MTT結(jié)果顯示:CuSO_4作用細(xì)胞后LDH漏出率顯著增加(P0.01),含通腑養(yǎng)髓方兔血清顯著降低CuSO_4損傷SH-SY5Y細(xì)胞的LDH漏出率(P0.05),及含丁苯酞兔血清可顯著降低CuSO_4損傷SH-SY5Y細(xì)胞的LDH漏出率(P0.01)。(4)DCFH-DA熒光染色發(fā)現(xiàn)CuSO_4可顯著增加SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS生成(P0.01),含通腑養(yǎng)髓方兔血清及含丁苯酞兔血清可顯著抑制CuSO_4誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(P0.01)。(5)JC-1染色發(fā)現(xiàn)CuSO_4誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P0.01),而含通腑養(yǎng)髓方兔血清及含丁苯酞兔血清呈劑量依賴性抑制CuSO_4誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低(P0.05)。(6)AO/EB染色結(jié)果顯示:正常組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)正常,大部分胞核經(jīng)AO染色后成呈現(xiàn)均勻的綠色。模型組大部分細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)濃染固縮狀態(tài),細(xì)胞形態(tài)改變,且部分細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)烈的橘紅色/紅色熒光。含通腑養(yǎng)髓方兔血清及含丁苯酞兔血清作用后,僅出現(xiàn)少數(shù)被EB染成橘紅色熒光的細(xì)胞,與正常細(xì)胞無顯著差異。(7)透射電鏡結(jié)果顯示:正常組細(xì)胞內(nèi)線粒體大小正常,形態(tài)完整,在細(xì)胞內(nèi)的分布正常,自噬體的數(shù)量較少。與正常組對(duì)比,模型組細(xì)胞染色質(zhì)凝聚,線粒體數(shù)目減少,線粒體結(jié)構(gòu)紊亂且多空泡化,部分空泡內(nèi)可見內(nèi)容物,并有部分線粒體被包裹進(jìn)囊泡里,自噬體較大,且數(shù)量明顯增加。與模型組對(duì)比,通腑養(yǎng)髓方和丁苯酞細(xì)胞內(nèi)未見明顯空泡,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常狀態(tài),且很難發(fā)現(xiàn)自噬體。(8)MDC染色結(jié)果顯示:與正常組對(duì)比,模型組的熒光強(qiáng)度顯著增加(P0.01),含通腑養(yǎng)髓方兔血清組和含丁苯酞兔血清組與模型組對(duì)比,熒光強(qiáng)度顯著減弱(P0.01)。(9)Western blot結(jié)果顯示:CuSO_4誘導(dǎo)Cyt-c的釋放(P0.01),而含通腑養(yǎng)髓方兔血清組和含丁苯酞兔血清組呈劑量依賴性抑制CuSO_4誘導(dǎo)的Cyt-c的釋放(P0.01)。(10)Western blot結(jié)果顯示:與正常組對(duì)比,模型組細(xì)胞內(nèi)LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1蛋白的表達(dá)顯著增加,mTOR、p-ULK蛋白的表達(dá)顯著降低(P0.01)。與模型組對(duì)比,含通腑養(yǎng)髓方兔血清組和含丁苯酞兔血清組的LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1蛋白表達(dá)顯著降低,mTOR、p-ULK蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01)。(11)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常組對(duì)比,模型組LKB1、AMPK、TSC2、P27、ULK1基因的表達(dá)顯著增加,mTOR基因的表達(dá)顯著降低(P0.01)。與模型組對(duì)比,含通腑養(yǎng)髓方兔血清組和含丁苯酞兔血清組LKB1、AMPK、TSC2、P27(P0.01)和ULK1(P0.05)基因的表達(dá)顯著降低,mTOR基因表達(dá)顯著增加(P0.01)。結(jié)論:高銅可通過誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激,上調(diào)自噬相關(guān)蛋白及基因LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27及ULK1的表達(dá),下調(diào)自噬相關(guān)蛋白及基因mTOR、p-ULK的表達(dá),導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡,而通腑養(yǎng)髓方可通過調(diào)控LKB1-AMPK信號(hào)通路,下調(diào)自噬相關(guān)蛋白及基因LKB1、AMPK、p-AMPK、TSC2、LC3A/B、P27、ULK1的表達(dá),上調(diào)自噬相關(guān)蛋白及基因mTOR、p-ULK的表達(dá),抑制自噬的發(fā)生,阻斷高銅誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【圖文】：

圖 1 顯微鏡觀察維生素 A 酸對(duì) SH-SY5Y 細(xì)胞的影響（n=3）（×400） The effect of vitamin Aacid on SH-SY5Y cells was observed by microscope（n=3）（×CuSO4造模濃度的篩選MTT結(jié)果顯示：CuSO4對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷呈現(xiàn)一定的量效和時(shí)效關(guān)系CuSO4作用劑量的增加及作用時(shí)間的延長，SH-SY5Y細(xì)胞存活率呈現(xiàn)下降P<0.01）。600μM CuSO4作用24h后，，存活率接近IC50，因此選擇該濃度CSH-SY5Y細(xì)胞24h造模濃度（見圖2）。

存活率接近IC50，因此選擇該濃度CuSO4作為SH-SY5Y細(xì)胞24h造模濃度（見圖2）。圖 2 不同劑量 CuSO4作用于 SH-SY5Y 細(xì)胞不同時(shí)間（n=6）Fig.2 The different concentration of copper act on SH-SY5Y cells at different times (n=6)(#P <0.05,##P<0.01, compared with control group; *P<0.05, **P<0.01, compared with model group;n=6)
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2622016