【摘要】：目的建立順鉑誘導的大鼠腎小管上皮(NRK-52E)細胞損傷體外模型,評價苦參堿在順鉑誘導的腎小管上皮細胞毒性損傷中的保護作用。通過對自噬相關監(jiān)測指標的檢測,進一步探討細胞自噬與苦參堿改善順鉑誘導的NRK-52E細胞損傷機制之間的關系。方法(1)體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細胞株,建立苦參堿和順鉑單獨或共同干預NRK-52E細胞模型。CCK-8法分別測定不同濃度的順鉑(0、5、25、50、75、100μmol/L)處理NRK-52E細胞24h后細胞的損傷情況,CCK-8法分別測定不同濃度的苦參堿(0、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)處理NRK-52E細胞24h后NRK-52E細胞的生存狀況。根據(jù)NRK-52E細胞的生存率的改變,選定順鉑及苦參堿的有效作用濃度,設置三個實驗分組:正常對照組、順鉑組、苦參堿+順鉑組;通過普通光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)的改變并拍照,同時各實驗分組采用CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定法確認細胞生長存活狀況及損傷情況。(2)根據(jù)實驗(1)確定的順鉑和苦參堿干預濃度以及實驗分組情況,建立苦參堿干預順鉑誘導的NRK-52E細胞損傷模型。在透射電子顯微鏡下觀察NRK-52E細胞的超微結構以及自噬體的形成情況;采用實時熒光定量PCR法(Real-time PCR法)檢測自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)mRNA的相對表達水平;Western Blot法測定NRK-52E細胞內LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白的表達情況;細胞免疫熒光法觀察LC3、p62蛋白的熒光表達情況。結果(1)與正常對照組相比,順鉑組細胞形態(tài)學變化明顯,細胞出現(xiàn)胞體萎縮、變圓等損傷甚至老化死亡情況,且NRK-52E細胞存活率明顯下降,并隨著順鉑濃度的增加,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,提示順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷模型建模成功。與正常對照組相比,CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定結果顯示順鉑組細胞存活率明顯下降(P0.05),細胞毒性損傷明顯上升(P0.05);與順鉑組相比,苦參堿干預后明顯改善順鉑誘導的細胞老化死亡情況,CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定結果亦顯示NRK-52E細胞生存力顯著提高(P0.05),細胞毒性損傷明顯降低(P0.05)。(2)透射電子顯微鏡觀察顯示,正常對照組NRK-52E細胞胞質內線粒體、內質網等細胞器結構清晰可見;順鉑組線粒體、內質網等腫脹變形,胞質內可見自噬體;苦參堿組明顯可見大量清晰的雙層膜結構樣的自噬體,其內可見部分未消化完全的破損細胞器。與正常對照組相比較,順鉑組:自噬相關蛋白相對定量顯示,LC3 mRNA及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達相對上調(P0.05),LC3蛋白免疫熒光標記檢測結果顯示出顆粒狀亮點,而p62蛋白熒光強度表現(xiàn)出減弱趨勢,提示順鉑可誘導細胞自噬水平上調;與順鉑組相比較,苦參堿+順鉑組:NRK-52E細胞中自噬相關基因LC3 mRNA表達進一步上調(P0.05),相應地LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達比值進一步增強(P0.05),LC3蛋白免疫熒光標記檢測呈現(xiàn)出明顯的團塊狀熒光聚集現(xiàn)象,而p62蛋白熒光顯著減弱,提示苦參堿進一步上調了順鉑誘導的細胞內自噬水平。結論苦參堿可改善順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷,該作用可能與其上調細胞自噬有關。
【圖文】：

噬改善順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷的研究 20擇合適濃度的順鉑誘導 NRK-52E 細胞毒性損傷模型濃度的順鉑處理 NRK-52E 細胞 24 h 后細胞存活率 所示，不同濃度順鉑刺激 NRK-52E 細胞 24 h 后，對均產生了不同程度的抑制。順鉑濃度為 0、5、25、，NRK-52E 細胞存活率依次為 99.97%、94.19%、77.2.76%。與正常對照組相比較，加入不同濃度順鉑處，，NRK-52E 細胞活力出現(xiàn)了明顯下降，差異具有統(tǒng)隨著順鉑濃度的增加，呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性生測結果選擇50μmol/L的順鉑濃度作為后續(xù)試驗中型的干預條件。（如下圖 1-1）

噬改善順鉑誘導的腎小管上皮細胞損傷的研究 2參堿對細胞活性產生明顯地抑制作用，差異具有統(tǒng) 1.0mg/ml 以內濃度的苦參堿對細胞活性未產生學意義（P＞0.05），即小于 1.0mg/ml 的濃度為苦據(jù)結果，后續(xù)實驗選用 0.5mg/ml 的非細胞毒性E 細胞，用于評價對順鉑所致 NRK-52E 細胞損傷模
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2620970