【摘要】：目的建立順鉑誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮(NRK-52E)細(xì)胞損傷體外模型,評價苦參堿在順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷中的保護(hù)作用。通過對自噬相關(guān)監(jiān)測指標(biāo)的檢測,進(jìn)一步探討細(xì)胞自噬與苦參堿改善順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞損傷機(jī)制之間的關(guān)系。方法(1)體外培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株,建立苦參堿和順鉑單獨(dú)或共同干預(yù)NRK-52E細(xì)胞模型。CCK-8法分別測定不同濃度的順鉑(0、5、25、50、75、100μmol/L)處理NRK-52E細(xì)胞24h后細(xì)胞的損傷情況,CCK-8法分別測定不同濃度的苦參堿(0、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)處理NRK-52E細(xì)胞24h后NRK-52E細(xì)胞的生存狀況。根據(jù)NRK-52E細(xì)胞的生存率的改變,選定順鉑及苦參堿的有效作用濃度,設(shè)置三個實驗分組:正常對照組、順鉑組、苦參堿+順鉑組;通過普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變并拍照,同時各實驗分組采用CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定法確認(rèn)細(xì)胞生長存活狀況及損傷情況。(2)根據(jù)實驗(1)確定的順鉑和苦參堿干預(yù)濃度以及實驗分組情況,建立苦參堿干預(yù)順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞損傷模型。在透射電子顯微鏡下觀察NRK-52E細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)以及自噬體的形成情況;采用實時熒光定量PCR法(Real-time PCR法)檢測自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)mRNA的相對表達(dá)水平;Western Blot法測定NRK-52E細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)情況;細(xì)胞免疫熒光法觀察LC3、p62蛋白的熒光表達(dá)情況。結(jié)果(1)與正常對照組相比,順鉑組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化明顯,細(xì)胞出現(xiàn)胞體萎縮、變圓等損傷甚至老化死亡情況,且NRK-52E細(xì)胞存活率明顯下降,并隨著順鉑濃度的增加,呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性,提示順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型建模成功。與正常對照組相比,CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定結(jié)果顯示順鉑組細(xì)胞存活率明顯下降(P0.05),細(xì)胞毒性損傷明顯上升(P0.05);與順鉑組相比,苦參堿干預(yù)后明顯改善順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞老化死亡情況,CCK-8法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定結(jié)果亦顯示NRK-52E細(xì)胞生存力顯著提高(P0.05),細(xì)胞毒性損傷明顯降低(P0.05)。(2)透射電子顯微鏡觀察顯示,正常對照組NRK-52E細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰可見;順鉑組線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等腫脹變形,胞質(zhì)內(nèi)可見自噬體;苦參堿組明顯可見大量清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)樣的自噬體,其內(nèi)可見部分未消化完全的破損細(xì)胞器。與正常對照組相比較,順鉑組:自噬相關(guān)蛋白相對定量顯示,LC3 mRNA及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)相對上調(diào)(P0.05),LC3蛋白免疫熒光標(biāo)記檢測結(jié)果顯示出顆粒狀亮點,而p62蛋白熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出減弱趨勢,提示順鉑可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平上調(diào);與順鉑組相比較,苦參堿+順鉑組:NRK-52E細(xì)胞中自噬相關(guān)基因LC3 mRNA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P0.05),相應(yīng)地LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比值進(jìn)一步增強(qiáng)(P0.05),LC3蛋白免疫熒光標(biāo)記檢測呈現(xiàn)出明顯的團(tuán)塊狀熒光聚集現(xiàn)象,而p62蛋白熒光顯著減弱,提示苦參堿進(jìn)一步上調(diào)了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬水平。結(jié)論苦參堿可改善順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷,該作用可能與其上調(diào)細(xì)胞自噬有關(guān)。
【圖文】：

噬改善順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的研究 20擇合適濃度的順鉑誘導(dǎo) NRK-52E 細(xì)胞毒性損傷模型濃度的順鉑處理 NRK-52E 細(xì)胞 24 h 后細(xì)胞存活率 所示，不同濃度順鉑刺激 NRK-52E 細(xì)胞 24 h 后，對均產(chǎn)生了不同程度的抑制。順鉑濃度為 0、5、25、，NRK-52E 細(xì)胞存活率依次為 99.97%、94.19%、77.2.76%。與正常對照組相比較，加入不同濃度順鉑處，，NRK-52E 細(xì)胞活力出現(xiàn)了明顯下降，差異具有統(tǒng)隨著順鉑濃度的增加，呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性生測結(jié)果選擇50μmol/L的順鉑濃度作為后續(xù)試驗中型的干預(yù)條件。（如下圖 1-1）

噬改善順鉑誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的研究 2參堿對細(xì)胞活性產(chǎn)生明顯地抑制作用，差異具有統(tǒng) 1.0mg/ml 以內(nèi)濃度的苦參堿對細(xì)胞活性未產(chǎn)生學(xué)意義（P＞0.05），即小于 1.0mg/ml 的濃度為苦據(jù)結(jié)果，后續(xù)實驗選用 0.5mg/ml 的非細(xì)胞毒性E 細(xì)胞，用于評價對順鉑所致 NRK-52E 細(xì)胞損傷模
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2620970