【摘要】：香葉木苷又名地奧司明(Diosmin)是香葉木素(3',5,7-三羥基-4'-甲氧基黃酮)的苷元部分,在柑橘類水果、蕓香科植物如兩面針、茜草科藥用植物如蓬子菜等天然植物中的含量豐富。近年來有報道,香葉木苷可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,對癌細(xì)胞具有特異性促凋亡活性和化學(xué)預(yù)防作用,因而被認(rèn)為是有潛質(zhì)的抗腫瘤藥物。本文將對香葉木苷對腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等方面的機(jī)制作以研究。本研究的主要結(jié)果如下:(1)利用清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基及ABTS自由基法、亞鐵離子螯合法和總還原力測定法對槲皮素、蘆丁、橙皮苷和香葉木苷的體外抗氧化活性進(jìn)行比較,驗(yàn)證了香葉木苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性,其抗氧化能力與槲皮素、蘆丁接近。(2)利用MTT法篩選香葉木苷對6種癌細(xì)胞系的增殖抑制作用,實(shí)驗(yàn)表明,香葉木苷對HepG2肝癌細(xì)胞的作用效果最明顯,150μg/m L時開始有效果,200~400μg/m L作用效果顯著且抑制率接近,因此選擇200μg/m L為最佳濃度深入研究香葉木苷抑制HepG2肝癌細(xì)胞的作用機(jī)制。(3)對香葉木苷作用于HepG2肝癌細(xì)胞的機(jī)制的進(jìn)一步研究得到以下結(jié)果:倒置顯微鏡直接觀察發(fā)現(xiàn)作用3~5 h后細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變形,7 h后出現(xiàn)小顆粒狀物質(zhì),部分細(xì)胞呈碎塊狀,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,給藥后出現(xiàn)枝狀結(jié)晶;HE染色后觀察發(fā)現(xiàn)3~5 h后胞內(nèi)染色質(zhì)聚集混亂,7 h后細(xì)胞膜被損壞,染色體斷裂,細(xì)胞周圍形成小泡,多數(shù)細(xì)胞呈碎裂狀;利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布,發(fā)現(xiàn)給藥組處于G0/G1、G2/M期細(xì)胞的數(shù)量顯著減少,S期細(xì)胞變化不明顯,推測香葉木苷可能破壞G0/G1、G2/M期;利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞處于凋亡晚期或死亡區(qū)域內(nèi);利用DCFH-DA法測定給藥后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化,發(fā)現(xiàn)給藥后熒光強(qiáng)度明顯增加,說明香葉木苷可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生;熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由原來的多角形、菱形變圓,產(chǎn)生大小不一的圓形小顆粒,部分細(xì)胞局部出現(xiàn)破洞,隨著作用時間延長細(xì)胞碎裂程度越高,推測香葉木苷可誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞發(fā)生壞死作用。(4)探討香葉木苷對HepG2肝癌細(xì)胞蛋白水平的影響,實(shí)驗(yàn)采用2-DE蛋白質(zhì)雙向電泳對細(xì)胞全蛋白進(jìn)行表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行篩選,在給藥組凝膠上檢測到976個蛋白點(diǎn),空白組凝膠上檢測到787個蛋白點(diǎn),其中只在給藥組中出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)有265個,只在空白組中出現(xiàn)的蛋白點(diǎn)有2個,相對于空白組,給藥組有42個蛋白點(diǎn)2倍上調(diào)。利用MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜技術(shù),對選取的7個差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析,并依據(jù)Gene Ontology、KEGG Pathway及String Network對其生物學(xué)功能進(jìn)行下一步分析。最終推測香葉木苷對HepG2肝癌細(xì)胞的損傷作用的可能通路如下:與ACTA2相關(guān)的可能通過破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),并調(diào)控Raf/MEK/ERK/Ca D通路與PI3K/Akt而起作用;與ENO2相關(guān)的可能與氨基酸的生物合成及糖代謝途徑相關(guān);與PKM相關(guān)可能與Ca信號通路和c AMP信號通路相關(guān);與Hsp A8相關(guān)的可能為調(diào)控TGF-β/RTK/clathrin、MKK4/7/JNK/c-JUN/Jun D或JNK/MKP/PTP/p38及NF-κB通路;與AFP相關(guān)的可能為調(diào)控Hippo-YAP和Akt通路。因此推測香葉木苷對HepG2肝癌細(xì)胞的破壞作用可能是多途徑共同參與的。
【圖文】：

技術(shù)路線

圖 3-7 槲皮素、蘆丁、香葉木苷、橙皮苷結(jié)構(gòu)Fig. 3-7 Structure of quercetin，rutin，diosmin and naringin研究發(fā)現(xiàn)黃酮化合物鄰二酚羥基清除自由基能力強(qiáng)于間二酚羥基，其中 B環(huán)酚羥基活性高。自由基清除能力與其酚羥基位置的電子轉(zhuǎn)移與脫氫能力有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn) TP 兒茶酚素的母核能與 5、7 位的兩個羥基基團(tuán)產(chǎn)生親核作用，從而使 TP 作為優(yōu)良的中子或氫供體，TP 可提供氫與自由基結(jié)合而被還原呈惰性化合物。如圖 3-7 a) 槲皮素的抗氧化能力較強(qiáng)，因?yàn)?C 環(huán)上有 3-OH，B 環(huán)上有 4-OH，同時 C 環(huán)上 2，3 位雙鍵和 4 位雙鍵氧共軛，A，B 環(huán)之間的電子離域，同時在氫供給后，使得芳氧自由基更穩(wěn)定�？臻g位阻的存在，，所以清除自由基能力有所降低。如圖 3-7 c) 香葉木苷本身存在多個酚羥基，推其可向外提供氫離子，而破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從而發(fā)揮抗氧化作用。Fe2+可通過Fenton 反應(yīng)使 H2O2解離生成 ROS，當(dāng)香葉木苷存在時可與 Fe2+發(fā)生螯合，從而減少自由基的產(chǎn)生�？寡趸瘎┰谇宄杂苫鶗r，清除活性與抗氧化劑分子中有效酚羥基的數(shù)目和新形成的抗氧化劑自由基的穩(wěn)定性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2620279