【摘要】：目的:炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因不明的慢性復發(fā)性腸道炎性疾病,包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)兩種亞型,臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、粘液便血。IBD發(fā)病機制尚不明確,近來有研究表明色氨酸(Tryptophan,Try)向犬尿氨酸(Kynurenine,Kyn)分解代謝加速,限速酶吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO-1)表達增高、犬尿氨酸含量增加可抑制體內免疫對異體抗原的應答,與IBD的發(fā)生密切相關。色氨酸是內源性的自由基清除劑和抗氧化劑,能夠對抗氧化性損傷并發(fā)揮抗炎作用;而犬尿氨酸類代謝物則具有免疫抑制作用,能誘導多種免疫細胞凋亡并削弱其分泌功能。此外,IBD可在一些具有致病潛力的腸道共生菌參與下,損傷腸屏障功能,最終引起自身免疫性炎癥反應。因此,基于色氨酸代謝通路和腸道菌群兩個角度,進一步了解IBD的病機,對尋求治療IBD的有效藥物具有重要的指導意義。廣藿香是治療暑濕蘊結誘發(fā)的胃腸疾患的嶺南道地藥材,具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),廣藿香及其主要有效成分——廣藿香油、廣藿香酮均具有抗IBD活性。而廣藿香醇(Patchouli Alcohol,PA)是廣藿香藥材和廣藿香油的指標性成分,具有抗炎、抗胃潰瘍和免疫調節(jié)等多種生物活性。因此,我們推測廣藿香醇可能具有抗IBD活性,并且本文擬基于色氨酸代謝通路和腸道菌群分析兩個角度,尋找IBD發(fā)病相關內源性代謝標志物,觀察DSS誘導IBD小鼠糞便結構組成及豐度,幫助我們進一步了解IBD的病機,深入對廣藿香藥效物質基礎的認識。方法:研究采用3%DSS水溶液自由飲用建立實驗性IBD模型,正常組(Control)給予等量自來水。造模當天開始,Control組及DSS組給予等體積藥物溶劑,其余各組動物連續(xù)7天灌胃給予相應藥物:廣藿香醇(PA,10、20、40 mg/kg)或柳氮磺胺吡啶(SASP,200 mg/kg)。實驗過程中,每天記錄體重并觀察糞便性狀、便血情況,進行疾病活動指數(shù)(Disease Activity Index,DAI)綜合評分。實驗第8天,剖取各組小鼠肛門至盲腸段結腸,記錄各組小鼠結腸長度。結合DAI和結腸長度,評價廣藿香醇治療IBD的療效。收集血漿,進行除蛋白處理、凍干、定容,隨后進行UPLC-MS測定;采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對Control組、DSS組和各給藥組進行模式識別;基于UPLC-MS測定結果搜索代謝組質譜數(shù)據(jù)庫,篩選跟DSS誘導IBD小鼠模型相關的內源性代謝物,對色氨酸代謝通路進行靶向分析,同時運用蛋白免疫印跡技術檢測通路相關限速酶(IDO-1和TPH-1)的表達,最后運用分子對接技術體外模擬廣藿香醇與IDO-1蛋白活性位點的結合。收集腸道內容物,提取總DNA,應用454焦磷酸測序分析平臺對得到的所有序列進行測序,進行物種分類、豐度分析、OTU韋恩圖、物種進化分析、聚類分析等,觀察組間差異,研究廣藿香醇對腸道微生物多樣性和種群結構等方面的影響。成果:本文研究發(fā)現(xiàn),在3%DSS誘導的IBD模型中,廣藿香醇各給藥組顯著降低小鼠DAI評分,恢復結腸長度。在血漿代謝輪廓分析中利用OPLS-DA分析方法進行數(shù)據(jù)預處理和造模,結果顯示:各組樣本分別聚集分布于不同的象限,提示DSS組與Control組樣本、DSS組與各給藥組有顯著的區(qū)別;結合UPLC-MS測定結果和代謝組質譜數(shù)據(jù)庫,最終篩選出19種潛在的內源性差異代謝產物,證明IBD的發(fā)生與氨基酸代謝、脂肪酸代謝、色氨酸代謝通路、谷胱甘肽、三羧酸循環(huán)和膽酸代謝息等息相關;同時我們鑒定出7種代謝物,用于區(qū)分正常動物和IBD模型動。其中,色氨酸代謝通路變化最為顯著,對通路上下游代謝產物Try、Kyn、5-HT、5-HTP靶向分析結果表明:廣藿香醇各給藥組的Try含量明顯升高,Kyn以及5-HT含量顯著下降;蛋白免疫印跡結果表明:廣藿香醇各給藥組顯著降低色氨酸代謝通路中重要限速酶IDO-1和TPH-1的表達;分子對接實驗結果表明:廣藿香醇與IDO-1蛋白活性位點結合從而抑制IDO-1過高表達。腸道菌群特定種屬數(shù)量分析結果表明廣藿香醇顯著抑制致病菌(例如變形菌、脫硫弧菌、幽門螺旋桿菌)的生長;然而顯著促進優(yōu)勢菌(例如擬桿菌、乳酸桿菌)的生長。結論:廣藿香醇具有較好的抗IBD活性,為治療IBD的潛在先導化合物。其作用機制可能是通過抑制相關限速酶的表達減緩色氨酸代謝速度,從而緩解IBD;同時調節(jié)腸內微生物組成和結構,保護腸道菌群微生態(tài)并保證其穩(wěn)定。
【圖文】：

廣州中醫(yī)藥大學 2018 屆碩士學位論文功能紊亂，升高 CD4+/CD8+比值，增表達[24]；對LPS誘導的急性肺損傷性[30, 31]；對人胃上皮細胞幽門螺旋療作用[32]；通過抑制巨噬細胞浸潤、吲哚美辛所致胃潰瘍以及應激性氧化應激的具有調節(jié)作用[35]。前期BD 作用，可顯著減輕 DSS 誘導 I 大鼠模型也有一定的治療作用。

在糞便性狀和血便狀態(tài)方面（圖 2B-C），DSS 組小鼠從第 3 天開始逐漸出現(xiàn)較為嚴重的稀便、血便，而廣藿香醇能不同程度減輕小鼠的這些病理情況，小鼠大便為較軟至濕軟狀，無明顯血便出現(xiàn)。如圖2D，，DSS組的DAI總評分明顯高于Control組（P < 0.01），而廣藿香醇則能顯著降低 DSS 誘導 IBD 小鼠的 DAI 評分，且呈劑量依賴關系（P <0.05）。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

1 周阿成;金黑鷹;;英夫利昔在克羅恩病治療中的應用[J];醫(yī)學綜述;2010年24期

2 王大海;殷志琦;張慶文;葉文才;張曉琦;張健;;廣藿香非揮發(fā)性化學成分的研究[J];中國中藥雜志;2010年20期

3 安賀軍;于玫;林芳冰;沈靜;;王新月教授論治潰瘍性結腸炎復發(fā)的思路[J];廣州中醫(yī)藥大學學報;2008年03期

4 錢屹];徐新才;邵利堅;符煒;;還原型谷胱甘肽減輕化療毒副反應的療效觀察[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2008年02期

5 于玫;王新月;安賀軍;;淺談瘀血與潰瘍性結腸炎[J];云南中醫(yī)中藥雜志;2008年02期

6 莫小路,嚴振,王玉生,汪小根;廣藿香精油對植物病原真菌的抑菌活性研究[J];中藥材;2004年11期

7 楊屰熹,謝培山;中藥廣藿香抗真菌成分——廣藿香酮(Pogostone)的分離及結構測定[J];科學通報;1977年07期

8 田海河;;董建華教授治療潰瘍性結腸炎的經(jīng)驗[J];北京中醫(yī)藥大學學報;1991年01期

相關博士學位論文 前1條

1 王婷婷;腸道菌群結構變化與結直腸癌發(fā)生發(fā)展關系的研究[D];上海交通大學;2012年

相關碩士學位論文 前2條

1 張慧慧;藿香對小鼠胃腸功能影響的研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2014年

2 高琰;炎癥性腸病中醫(yī)證候與T細胞亞群的相關研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2013年

本文編號：2619658