【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互之間存在著雙向調(diào)節(jié)機(jī)制,一個(gè)系統(tǒng)的改變會(huì)影響另外一個(gè)系統(tǒng)的功能。神經(jīng)系統(tǒng)可通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能,免疫系統(tǒng)可通過(guò)細(xì)胞因子等免疫活性物質(zhì)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能,導(dǎo)致神經(jīng)精神及行為等的改變。其中,外周免疫系統(tǒng)對(duì)中樞學(xué)習(xí)記憶功能的影響是近年生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。為了研究免疫功能異常對(duì)中樞學(xué)習(xí)記憶功能的影響,本課題選取三種代表性先天性免疫缺陷小鼠和一種獲得性免疫功能異常,即脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)所致免疫功能異常小鼠,觀察免疫功能異常對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響。在此基礎(chǔ)上,研究了中藥經(jīng)典方劑六味地黃湯(LW)及其活性部位LW-AFC的改善作用及其可能的機(jī)制。取得的結(jié)果包括以下兩部分:第一部分免疫功能異常對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響1.先天性免疫缺陷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究先天性免疫缺陷小鼠中,Nude小鼠先天無(wú)胸腺,不能使T細(xì)胞正常分化,造成T淋巴細(xì)胞缺陷;SCID小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥狀,T、B淋巴細(xì)胞功能均缺失,但有正常的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞;NOD-SCID小鼠T、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能缺失。選取2月齡雄性Nude(BALB/c系)、SCID、NOD-SCID三種免疫缺陷小鼠,以BALB/c小鼠作為對(duì)照。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與BALB/c小鼠相比,SCID小鼠測(cè)試期逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間無(wú)明顯變化;NOD-SCID小鼠測(cè)試期逃避潛伏期明顯降低(P0.05),穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間無(wú)明顯變化。穿梭箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與BALB/c小鼠相比,Nude小鼠測(cè)試期主動(dòng)回避次數(shù)明顯降低(P0.01);SCID和NOD-SCID小鼠測(cè)試期主動(dòng)回避次數(shù)無(wú)明顯變化,提示T淋巴細(xì)胞缺陷的Nude小鼠主動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,先天性T細(xì)胞缺陷可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力降低。2.LPS誘導(dǎo)免疫功能異常對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的一種脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物,腹腔注射LPS后,引發(fā)炎癥反應(yīng),在殺傷、清除病原體的同時(shí)也對(duì)宿主組織細(xì)胞產(chǎn)生損害反應(yīng),引起免疫損傷。本研究采用單次腹腔注射LPS所致急性免疫功能異常和長(zhǎng)期多次腹腔注射LPS所致慢性免疫功能異常小鼠研究獲得性免疫功能異常對(duì)中樞學(xué)習(xí)記憶功能的影響。2.1單次腹腔注射LPS對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響選取2-3月齡雄性C57小鼠,環(huán)境適應(yīng)后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),每天實(shí)驗(yàn)1次,共進(jìn)行6天,前1-5天為訓(xùn)練期,第6天為測(cè)試期。分別于第1天學(xué)習(xí)前、第1天學(xué)習(xí)后、第3天學(xué)習(xí)前、第6天(測(cè)試期)前單次腹腔注射LPS(250μg/kg)觀察LPS對(duì)學(xué)習(xí)記憶中獲取、鞏固和提取信息能力的影響。結(jié)果顯示,第1天學(xué)習(xí)前注射LPS,與對(duì)照組相比,模型組小鼠學(xué)習(xí)期和測(cè)試期各指標(biāo)均無(wú)明顯變化,提示LPS對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶獲取可能無(wú)明顯影響;第1天學(xué)習(xí)后立即注射LPS,與對(duì)照組相比,模型組小鼠第2天逃避潛伏期顯著增加(P0.05),后續(xù)學(xué)習(xí)期和測(cè)試期各指標(biāo)均無(wú)明顯變化,提示LPS可能影響了小鼠的學(xué)習(xí)記憶提取;第3天學(xué)習(xí)前和第6天測(cè)試前分別注射LPS,與對(duì)照組相比,模型組小鼠學(xué)習(xí)期和測(cè)試期各指標(biāo)均無(wú)明顯變化,提示LPS對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶鞏固可能無(wú)明顯影響。以上結(jié)果提示,第1天學(xué)習(xí)后單次腹腔注射LPS(250μg/kg)可以顯著降低小鼠學(xué)習(xí)記憶中鞏固和提取信息的能力,這可能與腹腔注射LPS導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有關(guān)。為確定上述學(xué)習(xí)記憶能力的損傷是否與LPS導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)有關(guān),進(jìn)而觀察了發(fā)生上述學(xué)習(xí)記憶損傷的時(shí)間小鼠自主活動(dòng)、游泳速度、體重、體溫、痛覺(jué)反應(yīng)及血漿和海馬中的細(xì)胞因子等指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示,小鼠自主活動(dòng)性、體重、體溫顯著降低(P0.001),游泳速度和痛覺(jué)反應(yīng)無(wú)明顯變化;血漿和海馬中IL-6水平顯著增加(P0.001)。以上結(jié)果提示,第1天學(xué)習(xí)后注射LPS引起的空間學(xué)習(xí)記憶損傷可能與LPS導(dǎo)致的免疫炎性反應(yīng)有關(guān)。2.2長(zhǎng)期腹腔注射LPS對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響選取2月齡雄性C57小鼠,連續(xù)腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2個(gè)月后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠學(xué)習(xí)期逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P0.01);測(cè)試期逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P0.001),穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著降低(P0.001)。以上結(jié)果提示長(zhǎng)期腹腔注射LPS(250μg/kg)能夠明顯損傷小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。第二部分LW及其活性部位對(duì)LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷的作用及機(jī)制研究六味地黃方(LW)是中醫(yī)“滋陰補(bǔ)腎”的經(jīng)典代表名方,LW-AFC是從六味地黃湯中分離獲得的由活性成分群構(gòu)成的組分中藥新藥。已有研究表明,LW對(duì)于免疫功能低下動(dòng)物的免疫功能具有改善作用;LW-AFC可顯著改善快速老化模型小鼠SAMP8和APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但LW及其活性部位LW-AFC對(duì)LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷是否具有改善作用尚不明確。1.LW及其活性部位對(duì)正常小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響選取3月齡雄性C57小鼠,灌胃給予LW(1.17g/kg)和LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg,1次/天,連續(xù)4周),通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察不同給藥時(shí)間對(duì)正常小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。與對(duì)照組相比,給予LW和LW-AFC1周、2周及4周后,小鼠學(xué)習(xí)期和測(cè)試期逃避潛伏期等指標(biāo)均無(wú)明顯變化。以上結(jié)果提示,灌胃給予LW及其活性部位,小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力不受影響。2.LW及其活性部位對(duì)LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷的作用2.1 LW及其活性部位對(duì)單次腹腔注射LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷的影響選取3月齡雄性C57小鼠,分別灌胃給予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg)及陽(yáng)性藥 TLR4 抑制劑 TAK-242(3mg/kg,ip)兩周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),并于第1天學(xué)習(xí)后單次腹腔注射LPS(250μg/kg),觀察其對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷的作用。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,腹腔注射LPS后第2天模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P0.05),TAK-242組小鼠對(duì)其具有明顯改善作用(P0.05),LW及LW-AFC組小鼠逃避潛伏期無(wú)明顯變化,且對(duì)測(cè)試期逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間無(wú)明顯影響。以上結(jié)果提示,LW、LW-AFC不能改善單次腹腔注射LPS(250μg/kg)所致空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。2.2 LW及其活性部位對(duì)長(zhǎng)期腹腔注射LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷的影響選取3月齡雄性C57小鼠,連續(xù)腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2個(gè)月,同時(shí)分別灌胃給予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg),腹腔注射給予陽(yáng)性藥(TAK-242,3mg/kg),然后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠測(cè)試期逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P0.001)、穿環(huán)次數(shù)顯著減少(P0.05)及目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著縮短(P0.01)。與模型組相比,LW、LW-AFC可顯著縮短小鼠測(cè)試期逃避潛伏期(P0.001)、增加穿環(huán)次數(shù)(P0.05)以及延長(zhǎng)目標(biāo)象限停留時(shí)間(P0.05),與陽(yáng)性藥TLR4抑制劑TAK-242作用相當(dāng)。以上結(jié)果提示,LW和LW-AFC可以改善長(zhǎng)期腹腔注射LPS所致空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。3.LW及其活性部位改善LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷的機(jī)制腹腔注射LPS會(huì)引起免疫炎性反應(yīng),產(chǎn)生的小分子炎性物質(zhì)入腦后引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活,進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,引起學(xué)習(xí)記憶損傷。根據(jù)第一部分研究結(jié)果,選取腹腔注射后發(fā)生學(xué)習(xí)記憶損傷的時(shí)間(14hr)以及學(xué)習(xí)記憶損傷得到恢復(fù)的時(shí)間(5天)取小鼠血漿和全腦進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)。采用免疫熒光染色觀察腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶損傷時(shí),與對(duì)照組相比,模型組全腦Ibal+細(xì)胞積分光密度(integral optical density,IOD)明顯增加(P0.01);陽(yáng)性藥TLR4抑制劑TAK-242對(duì)其有明顯的降低作用(P0.001);LW、LW-AFC可顯著降低全腦Ibal+細(xì)胞IOD(P0.001)。學(xué)習(xí)記憶損傷得到恢復(fù)時(shí),與對(duì)照組相比,模型組小鼠全腦Ibal+細(xì)胞IOD無(wú)明顯變化;與模型組相比,TAK-242、LW及LW-AFC對(duì)小鼠腦中Ibal+細(xì)胞IOD無(wú)明顯影響。結(jié)果提示腹腔注射LPS后小鼠腦中小膠質(zhì)細(xì)胞激活,LW、LW-AFC能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。采用Luminex技術(shù)檢測(cè)血漿和海馬中促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1 β、RANTES、MCP-1、GM-CSF、IFN-γ)和抗炎因子(IL-4、IL-10)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的含量。結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)記憶損傷時(shí),與對(duì)照組相比,模型組血漿和海馬中促炎因子IL-6、RANTES水平顯著升高(P0.001)、血漿中抗炎因子IL-10水平顯著降低(P0.001),TAK-242可顯著降低促炎因子水平(P0.05);與模型組相比,LW-AFC組海馬中促炎因子IL-6、MCP-1的水平顯著降低(P0.05)。學(xué)習(xí)記憶損傷得到恢復(fù)時(shí),與對(duì)照組相比,模型組血漿和海馬中炎性相關(guān)細(xì)胞因子水平無(wú)明顯變化。以上結(jié)果提示腹腔注射LPS后小鼠血漿和海馬中促炎因子水平升高、抗炎因子水平降低;LW-AFC能夠抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放。以上論述說(shuō)明LW-AFC能夠直接抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,進(jìn)而降低海馬中升高的炎性細(xì)胞因子水平來(lái)改善LPS所致學(xué)習(xí)記憶損傷。綜合以上研究結(jié)果,本研究可以得出以下結(jié)論:1.先天性T淋巴細(xì)胞缺陷會(huì)降低主動(dòng)回避學(xué)習(xí)記憶能力。2.腹腔注射LPS所致免疫功能異常會(huì)引起中樞學(xué)習(xí)記憶損傷。3.給予LW、LW-AFC不影響正常小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。4.LW、LW-AFC能夠改善腹腔注射LPS所致免疫功能異常引起的中樞學(xué)習(xí)記憶損傷,這可能是通過(guò)抑制腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和降低血漿及海馬中升高的炎性細(xì)胞因子水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。
【圖文】：

２．２．１邋ＬＷ及其活性部位對(duì)單次腹腔注射ＬＰＳ所致學(xué)習(xí)記憶損傷的影響逡逑在Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實(shí)驗(yàn)的空間學(xué)習(xí)期第一天結(jié)束后單次腹腔注射ＬＰＳ，與對(duì)照組相比，逡逑模型組小鼠學(xué)習(xí)期第二天潛伏期明顯延長(zhǎng)，而ＴＡＫ－２４２組潛伏期顯著低于模型組（圖２－７Ａ）。逡逑結(jié)果說(shuō)明，陽(yáng)性藥ＴＡＫ－２４２可以顯著改善小鼠學(xué)習(xí)期的學(xué)習(xí)記憶能力。在空間記憶期，與逡逑對(duì)照組相比，模型組逃避潛伏期有延長(zhǎng)的趨勢(shì)、穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留時(shí)間有減少的趨逡逑勢(shì)；與模型組相比，，ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ組逃避潛伏期有縮短的趨勢(shì)，穿環(huán)次數(shù)和目標(biāo)象限停留逡逑時(shí)間有增加的趨勢(shì)（圖２－７Ｂ，Ｃ，Ｄ）。說(shuō)明ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ有改善ＬＰＳ所致急性炎癥模型小鼠逡逑學(xué)習(xí)記憶能力損傷的趨勢(shì)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑６０１邐６０－逡逑５０．邐0邐５０－邐＊逡逑ｒ邐ｒ．邋？？

■■逡逑注：小鼠全腦染色（ｘｌ４）邋：邋Ａ．空白對(duì)照組；Ｂ．模型組；Ｃ．陽(yáng)性藥組；Ｄ．六味地黃組；Ｅ．六味地黃苷糖組。逡逑小鼠海馬區(qū)域染色（ｘ６０）邋：邋Ｆ．空白對(duì)照組；Ｇ．模型組；Ｈ．陽(yáng)性藥組；Ｉ．六味地黃組；Ｊ．六味地黃苷糖組，逡逑圖２－９邋ＬＷ及其活性部位對(duì)全腦及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響（腹腔注射ＬＰＳ邋１４ｈｒ后）逡逑ＩＨＨ逡逑■■逡逑注：小鼠全腦染色（Ｍ４）邋：邋Ｋ．空白對(duì)照組；Ｌ．模型組；Ｍ．陽(yáng)性藥組；Ｎ．六味地黃組；０．六味地黃苷糖組。逡逑小鼠海馬區(qū)域染色（ｘ６０）邋：邋Ｐ．空白對(duì)照組；Ｑ．模型組；Ｒ．陽(yáng)性藥組；Ｓ．六味地黃組；Ｔ．六味地黃苷糖組。逡逑圖２－１０邋ＬＷ及其活性部位對(duì)全腦及海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響（腹腔注射ＬＰＳ邋５天后）逡逑３５逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2619539