【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)相互之間存在著雙向調節(jié)機制,一個系統(tǒng)的改變會影響另外一個系統(tǒng)的功能。神經(jīng)系統(tǒng)可通過神經(jīng)遞質、神經(jīng)肽等生物活性物質調節(jié)免疫系統(tǒng)功能,免疫系統(tǒng)可通過細胞因子等免疫活性物質調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能,導致神經(jīng)精神及行為等的改變。其中,外周免疫系統(tǒng)對中樞學習記憶功能的影響是近年生命科學的研究熱點之一。為了研究免疫功能異常對中樞學習記憶功能的影響,本課題選取三種代表性先天性免疫缺陷小鼠和一種獲得性免疫功能異常,即脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導所致免疫功能異常小鼠,觀察免疫功能異常對學習記憶能力的影響。在此基礎上,研究了中藥經(jīng)典方劑六味地黃湯(LW)及其活性部位LW-AFC的改善作用及其可能的機制。取得的結果包括以下兩部分:第一部分免疫功能異常對學習記憶能力的影響1.先天性免疫缺陷小鼠學習記憶能力的研究先天性免疫缺陷小鼠中,Nude小鼠先天無胸腺,不能使T細胞正常分化,造成T淋巴細胞缺陷;SCID小鼠表現(xiàn)出嚴重的聯(lián)合免疫缺陷癥狀,T、B淋巴細胞功能均缺失,但有正常的NK細胞、巨噬細胞和粒細胞;NOD-SCID小鼠T、B淋巴細胞和NK細胞功能缺失。選取2月齡雄性Nude(BALB/c系)、SCID、NOD-SCID三種免疫缺陷小鼠,以BALB/c小鼠作為對照。Morris水迷宮實驗結果顯示,與BALB/c小鼠相比,SCID小鼠測試期逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留時間無明顯變化;NOD-SCID小鼠測試期逃避潛伏期明顯降低(P0.05),穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留時間無明顯變化。穿梭箱實驗結果顯示,與BALB/c小鼠相比,Nude小鼠測試期主動回避次數(shù)明顯降低(P0.01);SCID和NOD-SCID小鼠測試期主動回避次數(shù)無明顯變化,提示T淋巴細胞缺陷的Nude小鼠主動回避學習記憶能力明顯下降。以上實驗結果表明,先天性T細胞缺陷可能會導致動物學習記憶能力降低。2.LPS誘導免疫功能異常對小鼠學習記憶能力的影響LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種脂質和多糖的復合物,腹腔注射LPS后,引發(fā)炎癥反應,在殺傷、清除病原體的同時也對宿主組織細胞產(chǎn)生損害反應,引起免疫損傷。本研究采用單次腹腔注射LPS所致急性免疫功能異常和長期多次腹腔注射LPS所致慢性免疫功能異常小鼠研究獲得性免疫功能異常對中樞學習記憶功能的影響。2.1單次腹腔注射LPS對小鼠學習記憶能力的影響選取2-3月齡雄性C57小鼠,環(huán)境適應后進行Morris水迷宮實驗,每天實驗1次,共進行6天,前1-5天為訓練期,第6天為測試期。分別于第1天學習前、第1天學習后、第3天學習前、第6天(測試期)前單次腹腔注射LPS(250μg/kg)觀察LPS對學習記憶中獲取、鞏固和提取信息能力的影響。結果顯示,第1天學習前注射LPS,與對照組相比,模型組小鼠學習期和測試期各指標均無明顯變化,提示LPS對小鼠學習記憶獲取可能無明顯影響;第1天學習后立即注射LPS,與對照組相比,模型組小鼠第2天逃避潛伏期顯著增加(P0.05),后續(xù)學習期和測試期各指標均無明顯變化,提示LPS可能影響了小鼠的學習記憶提取;第3天學習前和第6天測試前分別注射LPS,與對照組相比,模型組小鼠學習期和測試期各指標均無明顯變化,提示LPS對小鼠的學習記憶鞏固可能無明顯影響。以上結果提示,第1天學習后單次腹腔注射LPS(250μg/kg)可以顯著降低小鼠學習記憶中鞏固和提取信息的能力,這可能與腹腔注射LPS導致的炎性反應有關。為確定上述學習記憶能力的損傷是否與LPS導致的免疫炎性反應有關,進而觀察了發(fā)生上述學習記憶損傷的時間小鼠自主活動、游泳速度、體重、體溫、痛覺反應及血漿和海馬中的細胞因子等指標的變化。結果顯示,小鼠自主活動性、體重、體溫顯著降低(P0.001),游泳速度和痛覺反應無明顯變化;血漿和海馬中IL-6水平顯著增加(P0.001)。以上結果提示,第1天學習后注射LPS引起的空間學習記憶損傷可能與LPS導致的免疫炎性反應有關。2.2長期腹腔注射LPS對小鼠學習記憶能力的影響選取2月齡雄性C57小鼠,連續(xù)腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2個月后進行Morris水迷宮實驗。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠學習期逃避潛伏期顯著延長(P0.01);測試期逃避潛伏期顯著延長(P0.001),穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留時間顯著降低(P0.001)。以上結果提示長期腹腔注射LPS(250μg/kg)能夠明顯損傷小鼠空間學習記憶能力。第二部分LW及其活性部位對LPS所致學習記憶損傷的作用及機制研究六味地黃方(LW)是中醫(yī)“滋陰補腎”的經(jīng)典代表名方,LW-AFC是從六味地黃湯中分離獲得的由活性成分群構成的組分中藥新藥。已有研究表明,LW對于免疫功能低下動物的免疫功能具有改善作用;LW-AFC可顯著改善快速老化模型小鼠SAMP8和APP/PS1轉基因AD模型小鼠的學習記憶能力。但LW及其活性部位LW-AFC對LPS所致學習記憶損傷是否具有改善作用尚不明確。1.LW及其活性部位對正常小鼠學習記憶能力的影響選取3月齡雄性C57小鼠,灌胃給予LW(1.17g/kg)和LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg,1次/天,連續(xù)4周),通過Morris水迷宮實驗觀察不同給藥時間對正常小鼠空間學習記憶能力的影響。與對照組相比,給予LW和LW-AFC1周、2周及4周后,小鼠學習期和測試期逃避潛伏期等指標均無明顯變化。以上結果提示,灌胃給予LW及其活性部位,小鼠空間學習記憶能力不受影響。2.LW及其活性部位對LPS所致學習記憶損傷的作用2.1 LW及其活性部位對單次腹腔注射LPS所致學習記憶損傷的影響選取3月齡雄性C57小鼠,分別灌胃給予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(0.4g/kg、0.8g/kg、1.6g/kg)及陽性藥 TLR4 抑制劑 TAK-242(3mg/kg,ip)兩周后進行Morris水迷宮實驗,并于第1天學習后單次腹腔注射LPS(250μg/kg),觀察其對小鼠學習記憶功能損傷的作用。結果顯示,與對照組相比,腹腔注射LPS后第2天模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(P0.05),TAK-242組小鼠對其具有明顯改善作用(P0.05),LW及LW-AFC組小鼠逃避潛伏期無明顯變化,且對測試期逃避潛伏期、穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留時間無明顯影響。以上結果提示,LW、LW-AFC不能改善單次腹腔注射LPS(250μg/kg)所致空間學習記憶能力損傷。2.2 LW及其活性部位對長期腹腔注射LPS所致學習記憶損傷的影響選取3月齡雄性C57小鼠,連續(xù)腹腔注射LPS(250μg/kg,1次/天)2個月,同時分別灌胃給予LW(1.17g/kg)、LW-AFC(1.6g/kg),腹腔注射給予陽性藥(TAK-242,3mg/kg),然后進行Morris水迷宮實驗。結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠測試期逃避潛伏期顯著延長(P0.001)、穿環(huán)次數(shù)顯著減少(P0.05)及目標象限停留時間顯著縮短(P0.01)。與模型組相比,LW、LW-AFC可顯著縮短小鼠測試期逃避潛伏期(P0.001)、增加穿環(huán)次數(shù)(P0.05)以及延長目標象限停留時間(P0.05),與陽性藥TLR4抑制劑TAK-242作用相當。以上結果提示,LW和LW-AFC可以改善長期腹腔注射LPS所致空間學習記憶能力損傷。3.LW及其活性部位改善LPS所致學習記憶損傷的機制腹腔注射LPS會引起免疫炎性反應,產(chǎn)生的小分子炎性物質入腦后引起小膠質細胞的激活,進而導致腦內神經(jīng)炎癥,引起學習記憶損傷。根據(jù)第一部分研究結果,選取腹腔注射后發(fā)生學習記憶損傷的時間(14hr)以及學習記憶損傷得到恢復的時間(5天)取小鼠血漿和全腦進行生化指標檢測。采用免疫熒光染色觀察腦內小膠質細胞的激活。結果顯示,學習記憶損傷時,與對照組相比,模型組全腦Ibal+細胞積分光密度(integral optical density,IOD)明顯增加(P0.01);陽性藥TLR4抑制劑TAK-242對其有明顯的降低作用(P0.001);LW、LW-AFC可顯著降低全腦Ibal+細胞IOD(P0.001)。學習記憶損傷得到恢復時,與對照組相比,模型組小鼠全腦Ibal+細胞IOD無明顯變化;與模型組相比,TAK-242、LW及LW-AFC對小鼠腦中Ibal+細胞IOD無明顯影響。結果提示腹腔注射LPS后小鼠腦中小膠質細胞激活,LW、LW-AFC能夠抑制小膠質細胞的活化。采用Luminex技術檢測血漿和海馬中促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1 β、RANTES、MCP-1、GM-CSF、IFN-γ)和抗炎因子(IL-4、IL-10)以及血管內皮生長因子(VEGF)的含量。結果顯示,學習記憶損傷時,與對照組相比,模型組血漿和海馬中促炎因子IL-6、RANTES水平顯著升高(P0.001)、血漿中抗炎因子IL-10水平顯著降低(P0.001),TAK-242可顯著降低促炎因子水平(P0.05);與模型組相比,LW-AFC組海馬中促炎因子IL-6、MCP-1的水平顯著降低(P0.05)。學習記憶損傷得到恢復時,與對照組相比,模型組血漿和海馬中炎性相關細胞因子水平無明顯變化。以上結果提示腹腔注射LPS后小鼠血漿和海馬中促炎因子水平升高、抗炎因子水平降低;LW-AFC能夠抑制促炎性細胞因子的釋放。以上論述說明LW-AFC能夠直接抑制小膠質細胞的活化,進而降低海馬中升高的炎性細胞因子水平來改善LPS所致學習記憶損傷。綜合以上研究結果,本研究可以得出以下結論:1.先天性T淋巴細胞缺陷會降低主動回避學習記憶能力。2.腹腔注射LPS所致免疫功能異常會引起中樞學習記憶損傷。3.給予LW、LW-AFC不影響正常小鼠的學習記憶能力。4.LW、LW-AFC能夠改善腹腔注射LPS所致免疫功能異常引起的中樞學習記憶損傷,這可能是通過抑制腦內小膠質細胞的活化和降低血漿及海馬中升高的炎性細胞因子水平來實現(xiàn)。
【圖文】：

２．２．１邋ＬＷ及其活性部位對單次腹腔注射ＬＰＳ所致學習記憶損傷的影響逡逑在Ｍｏｒｒｉｓ水迷宮實驗的空間學習期第一天結束后單次腹腔注射ＬＰＳ，與對照組相比，逡逑模型組小鼠學習期第二天潛伏期明顯延長，而ＴＡＫ－２４２組潛伏期顯著低于模型組（圖２－７Ａ）。逡逑結果說明，陽性藥ＴＡＫ－２４２可以顯著改善小鼠學習期的學習記憶能力。在空間記憶期，與逡逑對照組相比，模型組逃避潛伏期有延長的趨勢、穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留時間有減少的趨逡逑勢；與模型組相比，，ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ組逃避潛伏期有縮短的趨勢，穿環(huán)次數(shù)和目標象限停留逡逑時間有增加的趨勢（圖２－７Ｂ，Ｃ，Ｄ）。說明ＬＷ、ＬＷ－ＡＦＣ有改善ＬＰＳ所致急性炎癥模型小鼠逡逑學習記憶能力損傷的趨勢。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑６０１邐６０－逡逑５０．邐0邐５０－邐＊逡逑ｒ邐ｒ．邋？？

■■逡逑注：小鼠全腦染色（ｘｌ４）邋：邋Ａ．空白對照組；Ｂ．模型組；Ｃ．陽性藥組；Ｄ．六味地黃組；Ｅ．六味地黃苷糖組。逡逑小鼠海馬區(qū)域染色（ｘ６０）邋：邋Ｆ．空白對照組；Ｇ．模型組；Ｈ．陽性藥組；Ｉ．六味地黃組；Ｊ．六味地黃苷糖組，逡逑圖２－９邋ＬＷ及其活性部位對全腦及海馬小膠質細胞活化的影響（腹腔注射ＬＰＳ邋１４ｈｒ后）逡逑ＩＨＨ逡逑■■逡逑注：小鼠全腦染色（Ｍ４）邋：邋Ｋ．空白對照組；Ｌ．模型組；Ｍ．陽性藥組；Ｎ．六味地黃組；０．六味地黃苷糖組。逡逑小鼠海馬區(qū)域染色（ｘ６０）邋：邋Ｐ．空白對照組；Ｑ．模型組；Ｒ．陽性藥組；Ｓ．六味地黃組；Ｔ．六味地黃苷糖組。逡逑圖２－１０邋ＬＷ及其活性部位對全腦及海馬區(qū)小膠質細胞活化的影響（腹腔注射ＬＰＳ邋５天后）逡逑３５逡逑
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2619539