【摘要】：以甘肅道地藥材當(dāng)歸為研究對象,基于補血活血、潤腸通便的傳統(tǒng)功效,完成三方面研究:篩選出當(dāng)歸潤腸通便、補血、活血的有效部位;明確當(dāng)歸補血活血、潤腸通便的藥效物質(zhì)基礎(chǔ);對當(dāng)歸藥材中主要有效成分進行定性定量分析。主要方法及結(jié)果如下:1、以市面上各種當(dāng)歸制劑的提取制備方法為依據(jù),制備當(dāng)歸7個不同的提取物。采用復(fù)方地芬諾酯建立小鼠便秘模型,以首次排黑便時間、6 h內(nèi)排便數(shù)量、糞便重量、小腸推進率、腸水分為觀察指標(biāo),比較7個不同提取部位潤腸通便的作用;采用環(huán)磷酰胺(CTX)與乙酰苯肼(APH)合用建立小鼠血虛模型,以胸腺指數(shù)(TI)、脾指數(shù)(SI)、紅細胞數(shù)(RBC)、白細胞數(shù)(WBC)、血小板數(shù)(PLT)、血紅蛋白數(shù)(HCT)、紅細胞壓積(HGB)的變化為觀察指標(biāo),比較7個不同提取部位補血的作用;以皮下注射鹽酸腎上腺素(Adr)結(jié)合冰水浴建立急性大鼠血瘀模型,以血漿粘度(PV)、全血粘度(WBV)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原含量(FIB)為觀察指標(biāo),比較7個不同提取部位活血的作用。數(shù)據(jù)首先采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理,以?x±S表示,再采用基于變異系數(shù)權(quán)重的模糊物元模型進行綜合評價。2、采用柱色譜、制備液相等方法對篩選出有效部位的化學(xué)成分進行分離、純化,根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)(~1H-NMR,~(13)C-NMR,DEPT等)對化合物的結(jié)構(gòu)進行解析;采用超高效液相單級四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS)建立該有效部位的指紋圖譜,用所掌握的對照品確定部分主要的化學(xué)成分,再根據(jù)已知化合物的分子量,推測出其他的化合物。同時,采用超高效液相建立有效部位中多成分(阿魏酸、洋川芎Qg酯I、洋川芎Qg酯H、阿魏酸松柏酯、Z-正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、歐當(dāng)歸Qg酯A)的定量分析方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、潤腸通便實驗:與正常對照組相比,模型組首次排黑便時間延長,6h內(nèi)排便粒數(shù)減少,糞便重量減輕,碳末推進率降低、腸重量減小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。與模型組相比,部位1、部位2、部位3、部位5和部位6均能明顯縮短首便排出時間,增加排便粒數(shù)及糞便重量,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),部位1、部位2、部位5和部位6均能明顯促進小腸運動,增強小腸推進性蠕動,增長碳末推進長度,提高碳末推進率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);部位1、部位2、部位3、部位5、部位6腸重量均顯著增加(P0.05)。模糊物元模型計算得到的貼進度最大值為0.70(部位2,70%乙醇浸漬部位)。2、補血實驗:與正常對照組比較,模型組動物胸腺指數(shù)降低(p0.01)、脾臟指數(shù)增加(p0.01),RBC、WBC、PLT、HCT、HGB均降低(P0.01),與模型組比較,陽性組(p0.01)、部位1(p0.05)組均能升高小鼠胸腺指數(shù);陽性組及部位1-7均能降低小鼠的脾臟指數(shù)(p0.01),陽性組及當(dāng)歸各個給藥組對小鼠RBC、WBC、PLT、HCT、HGB各有不同程度的升高,其中當(dāng)歸水提組及浸漬組的效果最為明顯(P0.01),7個部位中,模糊物元模型計算得到的貼進度最大值為0.50(部位2,70%乙醇浸漬部位)。3、活血實驗:與正常對照組相比,模型組WBV及PV均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),PT、APTT和TT時間縮短,其中APTT、TT差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01),FIB升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),與模型組比較,部位1、部位2的TT升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。部位2的PT及TT降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05和p0.01),7個部位中,模糊物元模型計算得到的貼進度最大值為0.527(部位2,70%乙醇浸漬部位)。4、分離、純化,共得到20個化合物,最終確定了16個化合物的結(jié)構(gòu),分別為發(fā)卡二醇(1),歐當(dāng)歸Qg酯A(2),7羥基-6-甲氧基香豆素(3)、咖啡酸乙酯(4),阿魏酸(5),4?,10?-香木蘭烷二醇(6),菠菜甾醇(7),4-羥基-苯乙酮(8),亞油酸(9),亞油酸三甘酯(10),亞油酸甲酯(11),β-谷甾醇(12),胡蘿卜苷(13),香草醛(14),2-丙基苯酚(15),Tokinolide B(16)。5、應(yīng)用UPLC-MS鑒定有效部位中的化合物,通過與對照品、其他已知化合物的分子量及相關(guān)參考文獻比對,確認了8個、推測了4個化合物所代表的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。在優(yōu)化的色譜條件下,阿魏酸、洋川芎Qg酯I、洋川芎Qg酯H、阿魏酸松柏酯、Z-正丁基苯酞、藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基苯酞、歐當(dāng)歸Qg酯A分別在0.00174~0.0348、0.00958~0.1916、0.0016~0.032、0.00646~0.1292、0.00326~0.0652、0.00842~0.1648、0.01036~0.2072、0.00766~0.1532 mg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD均小于3%。通過以上實驗,篩選出了當(dāng)歸補血、活血、潤腸通便的有效部位為70%乙醇浸漬部位;從有效部位中明確了16個化合物的結(jié)構(gòu),其中4?,10?-香木蘭烷二醇(6),2-丙基苯酚(15)屬首次從當(dāng)歸中分離得到;所建立的定性定量分析方法準(zhǔn)確、靈敏度高,可為更加全面控制當(dāng)歸藥材的質(zhì)量提供實驗依據(jù)。
【圖文】：

圖 1 阿魏酸含量隨浸漬次數(shù)的變化圖re of ferulic acid content with changes in the number of imp劑的提取制備方法為依據(jù)，制備了當(dāng)歸 7 不同的提、水+70%乙醇回流提取法的浸膏得率均在 50%以上粉末，置干燥器內(nèi)保存，以備做藥效試驗。第二節(jié) 當(dāng)歸潤腸通便有效部位的篩選

圖 5 70%乙醇浸漬物樣品的總離子流色譜圖Fig.5 Total ion chromatogram of a 70% ethanol impregnated sample在正離子模式下得到保留時間為 14.372 min 的色譜峰，MS 圖譜中檢測到母離子 m/z243.1[M+H]+，m/z 264.4[M+Na]+，與已知化合物的分子量對比，推測該化合物為肉豆蔻酸甲酯（methyl myristate），分子式為 C15H30O2，質(zhì)譜圖見附錄。在正離子模式下得到保留時間為 20.896 min 的色譜峰，MS 圖譜中檢測到母離子 m/z237.1[M+H]+，m/z 259.2[M+Na]+，與已知化合物的分子量對比，推測該化合物為順丁烯二酸（4-hydroxy-2,5-dimethylphenyl)maleic acid），分子為 C12H12O5，質(zhì)譜圖見附錄。在正離子模式下得到保留時間為 36.568 min 的色譜峰，MS 圖譜中檢測到母離子m/z 427.3[M+H]+，m/z 449.3[M+Na]+，與已知化合物的分子量對比，，推測該化合物為羊毛甾醇（lanosterol），分子式為 C29H50O，質(zhì)譜圖見附錄。在正離子模式下得到保留時間為 40.522 min 的色譜峰，MS 圖譜中檢測到母離子
【學(xué)位授予單位】：甘肅中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5;R284.2

【參考文獻】

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本文編號：2619358