【摘要】：研究背景和目的中醫(yī)理論認為“腎主生殖”,然而實驗和臨床研究表明“肝司生殖”也得到了廣泛的認同。肝主疏泄,使精氣得以疏泄,肝藏血,使血量得以調(diào)節(jié)。根據(jù)“精血同源”理論,肝血充足,則生殖之精得以轉(zhuǎn)化;肝主疏泄,能調(diào)暢氣血和協(xié)調(diào)沖任,遂男子精壯,女子經(jīng)調(diào),而后方能子;而且肝經(jīng)繞陰器,對生殖有直接的聯(lián)系,故而有“肝司生殖”之說。實驗研究表明母體在妊娠前、妊娠期間、分娩后各個階段承受的應(yīng)激均不利于子代的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,并有可能在一定程度上造成子代的行為異常。查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)之前關(guān)于產(chǎn)前應(yīng)激對子代的實驗研究大多側(cè)重于妊娠后應(yīng)激對子代的影響,而對于孕前應(yīng)激對子代的影響卻少有研究。肝郁證常模型采用慢性束縛應(yīng)激方法,所以研究孕前肝郁對于子代神經(jīng)發(fā)育情況的影響意義重大。因此,基于“肝司生殖”,本課題通過慢性束縛應(yīng)激復(fù)制出肝郁母鼠,然后與正常雄性大鼠交配,將孕育出的子代大鼠作為研究對象,研究母體孕前肝郁對于子代雄性大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目的變化,分析其機制是否與孕前肝郁對子代雄性大鼠海馬中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-Derived neurotrophic factor,BDNF)和谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)2A和2B受體表達的異常有關(guān),并于造模后對母鼠采用柴胡疏肝散干預(yù)以了解其對子代雄鼠海馬中BDNF、NR_(2 A)和N R_(2 B)的表達是否有影響。本課題是繼研究肝郁對于生殖機能影響之后,對存活21天的雄性子代鼠海馬BDNF,NMDA受體表達及海馬神經(jīng)元情況的進一步研究,為優(yōu)生優(yōu)育提供科學(xué)依據(jù)和新思路。研究方法:雌性Wistar大鼠18只,體重240±20g,鼠齡10-11周;在excel表格中隨機分為正常組,模型組和柴胡疏肝散組,每組6只。雄性Wistar大鼠9只,體重220±20g,鼠齡10-11周。適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后,采用慢性束縛應(yīng)激方法復(fù)制肝郁證雌性大鼠模型。雄性Wistar大鼠9只正常喂養(yǎng),暫不予分組。分別在實驗的第0、7、14、21天觀察大鼠宏觀表征,稱量大鼠體重,在實驗的第21天用高架十字迷宮實驗記錄行為學(xué)。慢性束縛應(yīng)激造模21天及評價模型成功后完成后,雌鼠與雄鼠按照2:1的比例合籠飼養(yǎng),每天8:00檢查雌鼠的陰道分泌物涂片,以顯微鏡下能觀查到精栓作為受孕的標(biāo)志,將已妊娠的雌鼠進行單籠飼養(yǎng)直至其分娩。出生后21天,雄性子代鼠分別按照其母體的分組分為模型子代組,正常子代組和中藥復(fù)方(柴胡疏肝散)干預(yù)子代組(簡稱“中藥子代組”)。通過免疫組織化學(xué)法檢測雄性子代大鼠海馬組織中BDNF、NR_(2A)與NR_(2B)蛋白的表達情況;通過q RT-PCR法檢測雄性子代大鼠海馬中BDNF、NR_(2A)與NR_(2B) m RNA的表達情況;通過用HE染色法觀察各組雄性子代大鼠海馬中神經(jīng)元細胞形態(tài)和數(shù)目的異常變化。結(jié)果1.孕前肝郁母鼠的造模和評價3周后,與正常組母鼠相比較,模型組母鼠表現(xiàn)為皮毛枯黃且無光澤,精神萎靡和倦怠,靜臥少動躲藏在角落,眼角存在異常分泌物,耳廓的顏色變淡,飲水和進食均減少,糞便多稀溏,肝郁癥狀明顯。而柴胡疏肝散組母鼠的狀態(tài)優(yōu)于模型組,接近于正常組母鼠的外觀和表現(xiàn)。2.免疫組化結(jié)果與雄性正常子代對照組相比較,模型子代組雄性大鼠海馬CA_3區(qū)BDNF蛋白的表達降低(P0.0 1),NR_(2 B)受體的表達降低(P0.0 1),均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,而NR_(2A)受體的表達雖有降低,但無統(tǒng)計學(xué)差異;與模型子代組雄性大鼠相比較,中藥子代組雄性大鼠海馬CA_3區(qū)NR_(2A)和NR_(2 B)受體的表達均有上升,且有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.0 5),而BDNF蛋白的表達則無統(tǒng)計學(xué)差異。與正常子代組雄性大鼠相比較,模型子代組雄性大鼠的海馬DG區(qū)BDNF和N R_(2 A)蛋白的表達均降低(P0.0 1),且均有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異,而NR_(2B)的表達雖也有降低但并無統(tǒng)計差異;與模型子代組雄性大鼠相比較,中藥子代組雄性大鼠海馬DG區(qū)NR_(2A)蛋白的表達升高(P0.01),NR_(2 B)受體蛋白的表達亦升高(P0.0 5),均有統(tǒng)計學(xué)差異,而B D N F的表達變化則無統(tǒng)計學(xué)意義。3.qRT-PCR實驗結(jié)果與正常子代組雄性大鼠相比,模型子代組雄性大鼠海馬中BDNF m RNA表達下調(diào)(P0.0 1),NR_(2 B )m R NA的表達下調(diào)(P0.0 5),NR_(2 A)的表達也有下調(diào)趨勢,但是無統(tǒng)計學(xué)差異;與模型子代組雄性大鼠相比,中藥子代組雄性大鼠海馬中的BDNF m RNA表達上調(diào)(P0.01),NR_(2B )m RN A的表達亦上調(diào)(P0.0 5),NR_(2 A)的表達也有上調(diào)趨勢,但是無統(tǒng)計學(xué)差異。4.HE染色結(jié)果與正常子代組雄性大鼠比較,模型子代組雄性大鼠海馬CA_3區(qū)和DG區(qū)損傷的神經(jīng)元數(shù)目增加,神經(jīng)元突觸的數(shù)量明顯減少,神經(jīng)細胞的排列亦紊亂而稀疏,出現(xiàn)明顯的核固縮現(xiàn)象;與模型子代組雄性大鼠比較,中藥子代組雄性大鼠海馬CA_3區(qū)與DG區(qū)損傷的神經(jīng)元數(shù)量和減少的突觸數(shù)量并無明顯差異。結(jié)論1 21天慢性束縛應(yīng)激可以復(fù)制出較為理想的肝郁證母鼠模型,且柴胡疏肝散能緩解母鼠肝郁證的癥狀表現(xiàn)。2母鼠孕前肝郁可能會通過下調(diào)雄性子代大鼠海馬CA_3區(qū)BDNF和NR_(2 B)受體蛋白的表達,下調(diào)雄性子代大鼠海馬DG區(qū)B D N F和NR_(2 A)受體蛋白的表達,以及下調(diào)雄性子代大鼠海馬中BDNF和NR_(2B) m RNA的表達,損傷海馬神經(jīng)元細胞,從而影響到雄性子鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。3柴胡疏肝散對母鼠肝郁證有確切的療效,其可能透過母體,通過逆轉(zhuǎn)雄性子代大鼠海馬CA_3區(qū)和DG區(qū)中NR_(2A)與NR_(2B)受體蛋白的表達或者BDNF與NR_(2B) m RNA的表達,而間接減緩母鼠孕前肝郁對雄性子代大鼠的影響。
【圖文】：

電泳約 30分鐘。5）曝光：在紫光燈觀察下，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。（如圖2-1）圖 2-1 各組雄性子代大鼠 RNA 瓊脂糖的凝膠成像情況(3)引物的合成與稀釋：Rat-BDNF Forward primer5'-3'：gCCCAACgAAgAAAACCATAReverse primer5'-3'：CCTCCAgCAgAAAgAgCAgARat-NR2A Forward primer5'-3'：TgCCACAACgAgAAgAATgA,Reverse primer5'-3'：TgCTCCCAgATgAAggTgATRat-NR2A Forward primer5'-3'：AAAgCCCCATCATTCTCCTT,Reverse primer5'-3'：CACCAgACTCggCACAATC由生工生物工程（上海）股份合成，按照說明書每 OD 加入適量的無 RNA 酶水，配置成 100μM 的貯存液。（4）cDNA的合成：

22圖3-1 各組母鼠實驗前后的體質(zhì)量的比較3.1.3 各組母鼠的高架十字迷宮行為測試結(jié)果（1）母鼠于雙側(cè)開放臂與封閉臂的進入次數(shù)實驗結(jié)果表明，與正常組母鼠比較，模型組母鼠雙側(cè)開放臂的進入次數(shù)減少(P＜0.01)，其進入雙側(cè)封閉臂的次數(shù)亦減少，但無統(tǒng)計學(xué)差異；與模型組母鼠相比較，中藥組母鼠雙側(cè)開放臂的進入次數(shù)增多(P＜0.01)，其進入雙側(cè)封閉臂的次數(shù)略有增多，但無統(tǒng)計學(xué)意義。表 3-2 各組母鼠雙側(cè)開放臂和封閉臂分別進入的次數(shù)（ x±s）組別 N 雙側(cè)封閉臂進入次數(shù) 雙側(cè)開放臂進入次數(shù)正常組 6 5.99±3.71 4.01±1.63模型組 6 4.28±1.57 1.15±1.08**中藥組 6 4.55±3.42 3.97±2.29▲▲注：與正常對照組比較，* *P＜ 0.01；與模型組比較，▲ ▲P＜ 0
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2618290