【摘要】：中藥在我國(guó)擁有悠久的歷史,其理論體系來(lái)自于中醫(yī)學(xué)的辨證論治,代謝組學(xué)是在基因組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的新型學(xué)科,用于揭示生命活動(dòng)現(xiàn)象和本質(zhì)。中藥現(xiàn)代化發(fā)展給代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了契機(jī),使得代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域獲得空前發(fā)展。中藥復(fù)方茵陳五苓散由六味藥組成,茵陳、澤瀉、白術(shù)、豬苓、茯苓、桂枝,來(lái)源為東漢末年醫(yī)學(xué)家張仲景的《金匱要略》,全方主治:“黃疸(傷寒或伏暑發(fā)黃、酒積黃疸、陰黃),小便不利,濕熱煩渴。”楊時(shí)泰《本草述鉤元》卷9:“燥黃、濕熱為陽(yáng)黃。又有陰黃。均以茵陳為君藥。根據(jù)寒熱癥狀配以不同的佐藥。(海藏)茵陳五苓散。治療一切黃疸。”方中以清利濕熱的茵陳為君藥,配合澤瀉、豬苓、茯苓利水滲濕,白術(shù)健脾燥濕,桂枝辛溫通陽(yáng)化氣行水。諸藥合用,共奏清熱解毒利濕、健脾和胃化濁之功。茵陳五苓散配伍較為復(fù)雜,多成分相互協(xié)同構(gòu)成了其效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)。目前對(duì)茵陳五苓散的研究較少,尤其對(duì)茵陳五苓散的治療機(jī)制的探索方面尚不十分明確。本文旨在探究茵陳五苓散干預(yù)三種疾病的代謝通路分析,采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/MS)技術(shù),利用線性回歸等分析方法,尋找潛在的差異性代謝物,采用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證其結(jié)構(gòu),構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)圖譜,從潛在差異性代謝物變化趨勢(shì)揭示茵陳五苓散對(duì)黃疸型肝損傷、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的影響。具體研究結(jié)果如下:一、基于代謝組學(xué)技術(shù)研究茵陳五苓散水煎液抗黃疸型肝損傷機(jī)制為探索茵陳五苓散在治療黃疸型肝損傷中對(duì)生物體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用。本研究以α-萘異硫氰酸酯灌胃大鼠,造成黃疸型肝損傷模型,模擬黃疸型肝損傷患者的病理狀態(tài),造模后對(duì)大鼠肝臟進(jìn)行病理切片,發(fā)現(xiàn)模型組較正常組肝臟表面被大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),動(dòng)物行為學(xué)顯示大鼠全身發(fā)黃。再采用GC/MS技術(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與正常組大鼠血清內(nèi)物質(zhì)的變化,將采集到數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS在線軟件進(jìn)行譜峰校準(zhǔn),校準(zhǔn)后的結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P12.0進(jìn)行主成分分析(PCA)及疊加最小偏二乘判別分析(SPLS-DA),篩選出14個(gè)潛在差異性代謝物分別為:纈氨酸、甘氨酸、琥珀酸、檸檬酸、棕櫚酸、肌醇、亞油酸、硬脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油酸、蘋果酸、花生四烯酸、膽固醇,通過(guò)MetPA進(jìn)行代謝通路富集,代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果顯示,與茵陳五苓散治療機(jī)制相關(guān)的3條主要代謝通路:花生四烯酸與亞油酸代謝通路、乙醛酸和二羧酸代謝通路、絲氨酸/絲氨酸/蘇氨基酸代謝通路。二、基于代謝組學(xué)技術(shù)研究茵陳五苓散抗高脂血癥作用機(jī)制為進(jìn)一步了解茵陳五苓散對(duì)高脂血癥大鼠代謝物的影響,探索茵陳五苓散治療高脂血癥的代謝通路。本研究給予大鼠高脂飼料模擬人體高血脂癥模型,病理切片顯示模型組肝臟表面布滿脂肪泡,生化試劑盒檢測(cè)造模后血清中總膽固醇和甘油三酯含量,發(fā)現(xiàn)模型組較正常組這兩項(xiàng)指標(biāo)顯著升高(p0.05),藥理學(xué)指標(biāo)顯示造模成功。將采集的血清采用GC/MS聯(lián)用技術(shù)分析,尿液采用HPLC/MS聯(lián)用技術(shù)分析。再將液質(zhì)與氣質(zhì)提取的數(shù)據(jù)上傳到XCMS在線軟件對(duì)譜峰進(jìn)行基線校正,峰識(shí)別,峰對(duì)齊等,并導(dǎo)入SIMCA-P12.0軟件和Metaboanalyst軟件進(jìn)行PCA與OPLS-DA化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理,從血清和尿液中一共篩選出16個(gè)與高脂血癥相關(guān)的潛在差異代謝表達(dá)物,分別為丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、絲氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、延胡索酸、�；撬�、甜菜堿、左旋肉堿、檸檬酸、草酰琥珀酸、磷酸羥基丙酮酸、三磷酸甘油、半乳糖醛酸、苯乙酰甘氨酸。將代謝物進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)富集,發(fā)現(xiàn)與茵陳五苓散調(diào)節(jié)最密切相關(guān)的5條代謝通路分別為D-谷氨酸與D-谷氨酸鹽代謝,絲氨酸/蘇氨酸/甘氨酸代謝,牛黃酸和亞牛黃酸代謝,乙醛酸和二羧酸代謝,丙氨酸/天門冬氨酸/谷氨酸代謝。三、基于代謝組學(xué)技術(shù)研究茵陳五苓散抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制為進(jìn)一步分析茵陳五苓散干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的代謝通路,本實(shí)驗(yàn)采用維生素D3注射液、摻有維生素D3粉劑的高脂飼料復(fù)合造模,造成動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型,模擬人體動(dòng)脈粥樣硬化病癥。對(duì)造模后的血清進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè),發(fā)現(xiàn)模型組較正常組體內(nèi)總膽固醇和甘油三脂含量顯著升高(P0.001),病理切片顯示模型組較正常組表面布滿脂肪滴與脂肪泡,主動(dòng)脈弓伴有粥樣沉淀。藥理指標(biāo)初步顯示模型成功,對(duì)SD大鼠的血清和尿液分別進(jìn)行氣質(zhì)與液質(zhì)分析,將分析的結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P12.0軟件進(jìn)行PCA、PLS-DA、OPLS-DA進(jìn)一步降維分析,篩出15個(gè)潛在差異性代謝物:甘油、甘氨酸、絲氨酸、肌醇、檸檬酸、亞油酸、血肌酐、膽固醇、尿肌酐、酪氨酸、3-羥基丁酸、苯丙氨酸、馬尿酸、半乳糖醛酸、苯乙酰甘氨酸,經(jīng)過(guò)MetPA富集后,共找到與茵陳五苓散調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化最密切的5條代謝通路:亞油酸代謝、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸的生物合成、絲氨酸/蘇氨酸/甘氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、甘油酯代謝。研究表明中藥復(fù)方茵陳五苓散參與的疾病調(diào)節(jié)機(jī)制涵蓋了多條代謝通路,干預(yù)三種疾病的共有通路:乙醛酸與而羧酸代謝通路、亞油酸代謝通路、絲氨酸/蘇氨酸/甘氨酸代謝通路。茵陳五苓散平衡能量代謝、抑制炎癥因子、清除自由基水平治療疾病。本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)技術(shù)研究茵陳五苓散對(duì)抗疾病模型的代謝通路,并識(shí)別和分析這些代謝通路,為臨床上合理使用茵陳五苓散提供理論依據(jù)。
【圖文】：

2.4 結(jié)果2.4.1 一般觀察灌服 ANIT 橄欖油溶液 48h 內(nèi)，無(wú)死亡現(xiàn)象。正常組大鼠飲食飲水正常，毛色光澤，，尿色清亮。高劑量實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性組較正常組無(wú)明顯改變。模型組大鼠厭食厭水、毛發(fā)散亂無(wú)光澤，尿液呈黃綠色。2.4.2 YCL 對(duì)黃疸型肝損傷大鼠肝臟 HE 染色病理形態(tài)改變的作用光鏡下可見：正常組大鼠的肝細(xì)胞排列十分整齊，結(jié)構(gòu)比較清晰，肝細(xì)胞的肝索與肝竇間僅少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；采用 ANIT 造模后，模型組大鼠肝細(xì)胞發(fā)生病變，肝細(xì)胞排列較紊亂，肝索肝竇間、中央靜脈周見大量炎細(xì)胞散在浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹，肝細(xì)胞呈明顯損傷狀態(tài)。造模成功。給予茵陳五苓散干預(yù)后，茵陳五苓散高劑量實(shí)驗(yàn)組相比于其它組，炎癥癥狀減輕明顯，肝索肝竇間炎細(xì)胞少量浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹明顯減輕。經(jīng)過(guò)茵陳五苓散干預(yù)后，疾病有較好的恢復(fù)情況。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2.4.3 經(jīng) GC/MS 分析得肝損傷大鼠血清代謝物豐度變化大鼠血清樣本 GC/MS 分析總離子流（TIC）圖見圖（2-2）所示，在相同保留時(shí)間下，模型組與正常組豐度有明顯差異，小分子物質(zhì)的含量、種類、數(shù)目差異較大，相同時(shí)間處物質(zhì)總含量差異明顯，進(jìn)一步推測(cè)模型組與正常組血清中小分子存在差異。在提取質(zhì)量控制樣品（QC）的 TIC 譜圖，譜圖分析結(jié)果：代謝物保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<2%；離子豐度值的 RSD＜10%，在整個(gè)采集數(shù)據(jù)進(jìn)程中氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)穩(wěn)定，得到的數(shù)據(jù)可信[76]。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 周寧;顏賢忠;;代謝性疾病的代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J];國(guó)際藥學(xué)研究雜志;2015年05期

2 吳凝;劉石密;萬(wàn)玲;黃會(huì)超;曹信;王瑞怡;王東生;;茵陳五苓散通過(guò)p38、p42/44MAPK通路調(diào)控高脂血癥大鼠LDL-C的研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2015年10期

3 朱繼孝;李雪n

本文編號(hào)：2618237