【摘要】：目的:本研究旨在通過生物信息技術(shù)、代謝組學(xué)高通量的測序技術(shù)、宏基因組技術(shù)等方法探究益脈顆粒治療動脈粥樣硬化的療效作用機制,并尋找相關(guān)腸道菌群和代謝產(chǎn)物的變化,及它們之間的相關(guān)性,為益脈顆粒在臨床上治療動脈粥樣硬化提供可靠的治療依據(jù)。材料與方法:1益脈顆粒療效機制研究:通過生物信息學(xué)技術(shù)對益脈顆粒的全部藥物的潛在調(diào)控的基因進行預(yù)測。應(yīng)用TCMBATMAN數(shù)據(jù)庫查詢益脈顆粒的飲片名稱,獲得各個藥物的主要成分;應(yīng)用DRUGBANK查詢藥物主要成分的作用靶點,再經(jīng)過uniprot進行映射,將其轉(zhuǎn)至人類基因;應(yīng)用Disgenet及TCD數(shù)據(jù)庫;獲得AS發(fā)病的相關(guān)基因,并將基因與益脈顆粒主要成分作用靶點進行交叉比對,推測益脈顆粒治療AS的作用靶點;應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建背景網(wǎng)絡(luò),計算各個靶點的節(jié)點度,根據(jù)節(jié)點度對上述靶點進行排序,最終獲得益脈顆粒作用于AS的潛在分子靶點,即根據(jù)益脈顆粒藥物構(gòu)成對藥物內(nèi)全部作用于AS的靶點基因進行韋恩圖繪制確定重要的靶向基因。選取SPF級C57BL/6J小鼠,日齡56d,12只,作為正常組(ZC組),予普通飲食+生理鹽水灌胃;選取SPF級ApoE-/-小鼠,日齡56d,60只,隨機分為5組,每組12只。其中模型組予高脂高膽固醇飲食+生理鹽水灌胃;益脈顆粒高劑量組(YF-G組)予高脂高膽固醇飲食+中藥高劑量灌胃;益脈顆粒中劑量組(YF-Z組)予高脂高膽固醇飲食+中藥中劑量灌胃;益脈顆粒低劑量組(YF-D組)予高脂高膽固醇飲食+中藥低劑量灌胃;西藥陽性藥物對照組(XY組)12只予高脂高膽固醇飲食+阿托伐他汀。連續(xù)治療12周。治療后進行腹主動脈采血,測定血脂、TNF-α、IL-6及血漿粘度和全血高、中、低切粘度、血沉、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等指標(biāo)。同時選取心肌血管組織進行組織病理學(xué)觀察,選取小鼠的主動脈檢測CES1,HMGCR,PPARD,PPARG等蛋白。2益脈顆粒治療動脈粥樣硬化性疾病的代謝組學(xué)研究:選取SPF級C57BL/6J小鼠,日齡28-56天,雄性,6只,作為正常組(ZC組),予普通飲食+生理鹽水灌胃。選取SPF級ApoE~(-/-)小鼠,日齡28-56天,雄性,24只,隨機分為4組,每組6只。其中模型組(MX組)予高脂高膽固醇飲食+生理鹽水灌胃,西藥陽性藥物對照組(XY組)予高脂高膽固醇飲食+阿托伐他汀組,中藥提取物陽性組(HP組)予高脂高膽固醇飲食+槲皮素,益脈顆粒治療組(YF組)予高脂高膽固醇飲食+中藥高劑量灌胃,持續(xù)治療12周。治療后對各組小鼠糞便進行非靶向的代謝組學(xué)檢測,以探索研究益脈顆粒治療動脈粥樣硬化性疾病的代謝組學(xué)變化,以及生物功能的改變情況。3利用16SrDNA分析益脈顆粒對動脈粥樣硬化小鼠腸道菌群影響研究:選取SPF級C57BL/6J小鼠,日齡28-56天,雄性,3只,作為正常組(ZC組),予普通飲食+生理鹽水灌胃。選取SPF級ApoE~(-/-)小鼠,日齡28-56天,雄性,12只,隨機分為4組,每組3只。模型組(MX組)予高脂高膽固醇飲食+生理鹽水灌胃;西藥陽性藥物對照組(HP組)予高脂高膽固醇飲食+槲皮素;益脈顆粒治療組(YF組)予高脂高膽固醇飲食+益脈顆粒組,持續(xù)治療12周。治療后將小鼠處死整理出小腸段樣本后,進行總DNA提取,并進行PCR測序小鼠腸道菌群16SrDNA,以分析各組小鼠腸道菌群的多樣性及物種的差異性,并將腸道菌群結(jié)果與代謝組學(xué)進行冗余分析,探尋二者之間的相關(guān)性。結(jié)果:1益脈顆粒作用機制研究:益脈顆粒所獲得的潛在重疊基因靶點共計235個,同AS發(fā)病相關(guān)基因共計18個。根據(jù)益脈顆粒藥物構(gòu)成的各組全部重疊的基因靶點共計4個,分別為CES1,HMGCR,PPARD及PPARG。并進一步預(yù)測LXR-α、ABCA1基因,推測益脈顆�？赡芡ㄟ^PPAR-γ/LXR-α/ABCA1的信號通路起到治療作用。益脈顆粒能夠有效調(diào)節(jié)AS小鼠TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-6、血液黏度、血液聚集性等水平,益脈顆粒各組的血脂、TNF-α、IL-6、血液黏度、血液聚集性等水平接近正常水平,且隨著益脈顆粒濃度的上升,與MX組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),與XY組比較,療效相當(dāng)甚至更優(yōu)。益脈顆粒除了可以有效下調(diào)CES1的表達,及上調(diào)HMGCR,PPARD,PPARG的表達外,亦可通過上調(diào)PPARG下游的LXR-α/ABCA1蛋白的表達,最終實現(xiàn)對AS的治療作用,作用效果且同益脈顆粒的濃度呈正比(P0.05)。YF-D、YF-Z組對CES1、PPARD、PPARG、LXR-α表達調(diào)節(jié)效果明顯,與MX組比較無差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。YF-G組對CES1,HMGCR,PPARD、PPARG、LXR-α、ABCA1蛋白表達調(diào)節(jié)效果明顯,與MX組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。光鏡下XY組、YF各組血管組織損傷得到修復(fù),YF-D組、YF-Z組、YF-G組血管各部位粗細(xì)不均,管腔內(nèi)未見斑塊,細(xì)胞間有較少的炎性細(xì)胞浸潤,YF-G組最少,伴有內(nèi)膜增厚,但均較MX組薄,其中YF-G的內(nèi)膜厚度較薄,YF-D組、YF-Z組肌層組織較高劑量組疏松,可見少量肌絲斷裂。2益脈顆粒治療動脈粥樣硬化性疾病的代謝組學(xué)研究:鑒定出益脈顆粒能夠改善AS小鼠過程中涉及的顯著差異的代謝物有14種,其中已知的4-硝基肉桂酸乙酯、腐殖酸、乙酸異丁酯、1-睪酮四氫吡喃醚、多培沙明、維生素k、羊角拗醇、麥角新等8種代謝物經(jīng)過治療后顯示被顯著調(diào)節(jié),正離子被下調(diào),負(fù)離子被上調(diào)涉及的代謝通路主要包括氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝等。3利用16SrDNA分析益脈顆粒對動脈粥樣硬化小鼠腸道菌群影響研究:PCoA結(jié)果顯示益脈顆粒能夠調(diào)節(jié)AS小鼠腸道菌群的多樣性變化,其中與HP組比較在門水平上以厚壁菌門、擬桿菌門為主,在種水平以紫單胞菌種和毛螺菌種為主,在屬水平以紫單胞菌屬和唇形菌屬為主,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與ZC、MX、HP組比較,YF厭氧弧菌、腸道巴恩斯氏菌、毛螺菌水平差異顯著(P0.05)。4腸道菌群與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析Rda結(jié)果顯示可以看出,螺旋體菌門對所有樣本代謝物都產(chǎn)生正向作用,與擬桿菌門和變形桿菌門呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系,而擬桿菌門與變形桿菌門對所有樣本代謝物都產(chǎn)生負(fù)向作用,二者呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系;螺旋體菌門與擬桿菌門數(shù)量變化對代謝物影響較為敏感,敏感代謝物依次為:有機雜環(huán)化合物、苯環(huán)型化合物、苯丙素和聚酮化合物、有機酸及其衍生物、脂類和脂質(zhì)樣分子和有機氧化合物。結(jié)論:1.益脈顆�？梢杂行抡{(diào)CES1的表達,上調(diào)HMGCR,PPARD,PPARG的表達,同時可通過上調(diào)PPARG下游的LXR-α/ABCA1蛋白的表達,有效調(diào)節(jié)AS小鼠血脂、血液黏度、炎癥因子水平等,起到治療AS的作用。2益脈顆粒能夠改善AS小鼠過程中涉及的顯著差異的代謝物有14種,其中已知的4-硝基肉桂酸乙酯、腐殖酸、乙酸異丁酯、1-睪酮四氫吡喃醚、多培沙明、維生素k、羊角拗醇、麥角新等8種代謝物經(jīng)過治療后顯示被顯著調(diào)節(jié),正離子下調(diào),負(fù)離子上調(diào)。益脈顆粒能夠通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、異生素的生物降解和代謝、脂質(zhì)代謝等代謝途徑,起到治療AS的作用。3益脈顆粒能夠通過改善厚壁菌門、擬桿菌門,紫單胞菌屬、唇形菌屬、厭氧弧菌、腸道巴恩斯氏菌、毛螺菌等,影響腸道菌群物種、結(jié)構(gòu)、菌群多樣性與代謝物情況,起到治療AS的作用。同時腸道菌屬(螺旋體菌門、擬桿菌門和變形桿菌門)與潛在生物標(biāo)志物(有機雜環(huán)化合物、苯環(huán)型化合物、苯丙素和聚酮化合物、有機酸及其衍生物、脂類和脂質(zhì)樣分子和有機氧化合物)具有強相關(guān)的互作關(guān)聯(lián)性。
【圖文】：
的表達并無顯著性的上調(diào)作用，阿托伐他汀雖然可以部分上調(diào) PPARG 的表達，使其高于MX 組和 YF-D 組（P<0.05）。但是，其表達仍然低于 YF-Z 和 YF-G 組。阿托伐他汀可以顯著性的上調(diào) HMGCR 的表達，同 YF-G 相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。如圖1。圖1 益脈顆粒對小鼠心血管靶向基因蛋白變化的影響
為進一步的確定在靶向蛋白在整個實驗過程中的變化情況，取各組不同蛋白的表達量（蛋白的灰度值）的平均數(shù)，進行熱圖制作，以表現(xiàn)在藥物應(yīng)用過程中蛋白的變化情況，見圖2。進一步對全部組別內(nèi)的蛋白的表達量制作熱圖（沈陽創(chuàng)東數(shù)據(jù)處理有限公司繪制）。根據(jù)所獲得的熱圖可知，在整個給藥過程中，XY 組的 CES1表達并未隨之上升，而 HMGCR 的表達量顯著性的高于 YF-G 組；另，XY 組及 YF-G 組的 PPARD 的表達情況類似，，而 YF-D/Z/G各組的 PPARD 表達均顯著性的高于 MX 組。而 XY組及 YF-G 組的 PPARG、LXR-α及 ABCA1蛋白表達情況類似。然而，在低劑量條件下，同 MX 組相比上述三個蛋白的表達情況并未顯著上升。圖 2 不同給藥處理對于靶向基因蛋白表達情況的影響注：A：ZC 組；B：MX 組；C：YF-D 組；D：YF-Z 組；E：YF-G 組；F：XY 組。2.3 益脈顆粒對血脂水平的影響益脈顆粒可降低小鼠的 TG，TC，LDL-C 水平。各組降低情況均同益脈顆粒的濃度呈正比
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【參考文獻】
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本文編號：
2617962
