【摘要】：目的:本實驗基于乳腺癌肝郁生熱、脾虛血弱的中醫(yī)基本病機(jī),選取疏肝健脾、養(yǎng)血清熱的經(jīng)典方劑丹梔逍遙散,從凋亡的角度出發(fā),探討丹梔逍遙散抗乳腺癌的作用及其機(jī)制,揭示了丹梔逍遙散可能通過調(diào)控乳腺癌細(xì)胞凋亡的途徑抗乳腺癌。材料與方法:6周齡SPF級BALB/c-nu雌性裸鼠32只,適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后,將密度為1×10~8/mL的MCF-7細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋窩處皮下,接種10d后造模成功。將成模后的裸鼠隨機(jī)分為4組,分別為模型組、丹梔逍遙散高劑量組(17.98g·kg~(-1))、中劑量組(8.99g·kg~(-1))和低劑量組(4.50g·kg~(-1)),各組n=8。術(shù)后給予灌胃處理,藥物按人和小鼠體表面積換算等效的給藥劑量的比值來計算灌胃量,按固定的時間灌服2次/d,連續(xù)給藥15d,模型組給予等量的生理鹽水。末次給藥1h后,脫頸椎處死裸鼠,剝離裸鼠的腋窩處皮下腫瘤組織。稱取新鮮的裸鼠腫瘤瘤體質(zhì)量,計算質(zhì)量抑制率。采用蘇木素和伊紅(HE)染色法觀察裸鼠移植瘤組織的形態(tài)學(xué)改變。Tunel染色法檢測腫瘤組織細(xì)胞凋亡。免疫印跡法(Western blot)檢測腫瘤組織中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cyt-c的表達(dá)。制備丹梔逍遙散中劑量組含藥血清。細(xì)胞分組:MCF-7細(xì)胞分為兩組,分別為空白血清組和丹梔逍遙散中劑量含藥血清組。采用MTT(噻唑藍(lán))比色法測定MCF-7細(xì)胞的增殖率,其中含藥血清體積分?jǐn)?shù)分別為10%、15%、20%,干預(yù)時間分別為12h、24h、48h、72h。采用流式細(xì)胞術(shù)分析MCF-7細(xì)胞周期、凋亡。采用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色法觀察MCF-7細(xì)胞凋亡。采用羅丹明123(Rh 123)熒光染色法觀察MCF-7細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。采用Western blot法檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Cyt-c的表達(dá)。結(jié)果:1.丹梔逍遙散對MCF-7裸鼠移植瘤的影響腫瘤質(zhì)量抑制率結(jié)果顯示,與模型組比較丹梔逍遙散高、中劑量組對MCF-7裸鼠移植瘤的質(zhì)量抑制率為29.89%(P0.05)、47.89%(P0.01),低劑量組與模型組無明顯差異。HE染色結(jié)果顯示,與模型組比較,丹梔逍遙散高、中劑量組腫瘤組織壞死灶顯著增加,胞漿淡染,其中中劑量組效果最為顯著,低劑量組與模型組無明顯差異。Tunel染色法結(jié)果表明,相比模型組,丹梔逍遙散高、中劑量組的腫瘤組織細(xì)胞凋亡率為22.45±7.55%(P0.05)、30.41±10.01%(P0.01),低劑量組與模型組無明顯差異。由于在腫瘤質(zhì)量抑制率測定、HE染色法、Tunel染色法中,丹梔逍遙散低劑量組與模型組的實驗結(jié)果均無明顯差異,所以丹梔逍遙散低劑量組不納入后續(xù)的Western Blot實驗中。Western blot法結(jié)果表明,丹梔逍遙散高劑量組上調(diào)凋亡蛋白Bax(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表達(dá),下調(diào)凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表達(dá);丹梔逍遙散中劑量組上調(diào)凋亡蛋白Bax(P0.01)、Caspase-3(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表達(dá),下調(diào)凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表達(dá),其中丹梔逍遙散中劑量組效果優(yōu)于高劑量組。2.丹梔逍遙散含藥血清對MCF-7細(xì)胞的影響MTT法結(jié)果顯示,與空白血清組比較,15%含藥血清組處理細(xì)胞12h、24h、48h、72h后,細(xì)胞的增殖能力明顯減弱(P0.05),其中15%含藥血清組處理細(xì)胞48h后效果最為顯著。其余各組相比空白血清組均沒有明顯差異(P0.05)。因此,選取血清體積分?jǐn)?shù)為15%、干預(yù)時間為48h作為后續(xù)實驗的干預(yù)條件。AO/EB染色結(jié)果顯示,與空白血清組比較,丹梔逍遙散中劑量含藥血清組作用于MCF-7細(xì)胞48h后,大部分細(xì)胞呈綠色深染熒光,溴化乙錠標(biāo)記的帶有紅色熒光的腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,相比空白血清組,丹梔逍遙散中劑量含藥血清干預(yù)MCF-7細(xì)胞48h后,細(xì)胞凋亡率上調(diào)至19.51%,空白血清組與丹梔逍遙散中劑量含藥血清組G1期細(xì)胞比例分別為42.83%、51.98%,S期細(xì)胞比例分別為54.23%、46.79%,與空白血清組比較,丹梔逍遙散中劑量含藥血清組的細(xì)胞合成前期比例明顯升高,合成期明顯減少。Rh 123熒光染色結(jié)果顯示,與空白血清組比較,丹梔逍遙散中劑量含藥血清組細(xì)胞線粒體膜電位明顯減低。Western blot法結(jié)果表明,丹梔逍遙散中劑量含藥血清組上調(diào)凋亡蛋白Bax(P0.01)、Caspase-3(P0.01)、Cyt-c(P0.01)的表達(dá),下調(diào)凋亡蛋白Bcl-2(P0.01)的表達(dá)。結(jié)論:1.丹梔逍遙散可能通過誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡的途徑抑制腫瘤的生長,且最佳給藥劑量為中劑量(8.99g·kg~(-1))。2.丹梔逍遙散誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bax、Caspase-3、Cyt-c的表達(dá),下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)3.丹梔逍遙散中劑量含藥血清可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡,其最佳工作濃度為15%血清體積分?jǐn)?shù),最佳作用時間為48h。4.丹梔逍遙散中劑量組含藥血清可能通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡。5.凋亡因子Bcl-2、Bax作用于線粒體后,調(diào)控線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mPTP)的異常打開,從而導(dǎo)致線粒體膜電位降低,向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)釋放凋亡因子Cyt-c,從而激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3,引發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng),最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這可能是丹梔逍遙散誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基本分子機(jī)制之一。
【圖文】：

圖 1-1 各組腫瘤組織的細(xì)胞形態(tài)（200×）模型組；B：丹梔逍遙散高劑量組；C：丹梔逍遙散中劑量組；D：丹梔逍遙散劑量組逍遙散對腫瘤組織細(xì)胞凋亡率的影響nel 染色法結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色，模型組中可見有少量細(xì)棕褐色。與模型組比較，丹梔逍遙散高、中劑量組中，有大量腫瘤組織細(xì)胞的染成棕褐色不均勻散在分布，且腫瘤組織細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.01）。散低劑量組與模型組無明顯差異。其中丹梔逍遙散中劑量組效果最為顯著見表 1-2。表 1-2 各組腫瘤組織細(xì)胞的凋亡率（ x±s，n=3）別 劑量（g·kg-1） 細(xì)胞凋亡率(％)

圖 1-2 丹梔逍遙散對腫瘤組織細(xì)胞凋亡的影響（400×）A：模型組；B：丹梔逍遙散高劑量組；C：丹梔逍遙散中劑量組；D：丹梔逍遙散低劑量組4 丹梔逍遙散對腫瘤組織凋亡蛋白表達(dá)的影響4.1 丹梔逍遙散高劑量組對腫瘤組織相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與模型組比較，，丹梔逍遙散高劑量組顯著上調(diào)凋亡蛋白 Bax（P＜0.01）、Cyt-c（P＜0.01）的表達(dá)，顯著下調(diào)凋亡蛋白 Bcl-2（P＜0.01）的表達(dá)。模型組與丹梔逍遙散高劑量組中的凋亡蛋白 Caspase-3 表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。見表 1-3，圖1-3。4.2 丹梔逍遙散中劑量組對腫瘤組織相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示，與模型組比較，丹梔逍遙散中劑量組顯著上調(diào)凋亡蛋白 Bax（P＜0.01）、Cyt-c（P＜0.01）、Caspase-3（P＜0.01）的表達(dá)，顯著下調(diào)凋亡蛋白 Bcl-2（P＜0.01）
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2616260