【摘要】：目的:通過運用細胞培養(yǎng)技術(shù)、動物實驗技術(shù)以及病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等實驗技術(shù),研究麻杏石甘湯對A型流感病毒介導(dǎo)的IL-6、MCP-1表達水平的影響,探討麻杏石甘湯對A型流感病毒免疫調(diào)節(jié)機制。方法:1.MTT法檢測麻杏石甘湯含藥血清對A型流感病毒感染的RAW264.7細胞活性的影響;用ELISA法檢測RAW264.7細胞上清中IL-6、MCP-1含量水平。2.建立動物模型,經(jīng)灌胃給藥或生理鹽水3天和7天后,處死小鼠,取小鼠肺組織、脾組織、胸腺組織和結(jié)腸組織。檢測各組小鼠體重、體重下降率、肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率、脾指數(shù)和胸腺指數(shù);用HE染色觀察小鼠肺組織和結(jié)腸組織病理變化;用ELISA法檢測小鼠血清中IL-6、MCP-1含量水平;用免疫組織化學(xué)的方法檢測小鼠肺組織、結(jié)腸組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平;用western blotting技術(shù)檢測肺組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平。結(jié)果:1.與10%濃度胎牛血清正常細胞對照組比較,濃度為50%、25%、12.5%、6.25%的大鼠空白血清作用24h、48h對應(yīng)的細胞活性O(shè)D值均顯著升高(p0.01),表明大鼠空白血清對RAW264.7細胞沒有毒性作用,RAW264.7細胞仍能繼續(xù)生長。與大鼠空白血清組比較,濃度為50%、25%、12.5%、6.25%的各大鼠含藥血清作用24h、48h對應(yīng)的細胞活性O(shè)D值無明顯差異(p0.05),表明各大鼠含藥血清對RAW264.7細胞沒有毒性作用�？紤]到常規(guī)細胞培養(yǎng)胎牛血清的濃度為10%,故本實驗選擇濃度為12.5%的大鼠含藥血清為后續(xù)實驗中加樣檢測相關(guān)指標(biāo)。2.與正常對照組比較,病毒對照組在流感病毒作用24h與48h的RAW264.7細胞上清中IL-6、MCP-1含量水平顯著升高(p0.01);與病毒對照組比較,給藥治療24h、48h的麻杏石甘湯組IL-6含量水平明顯下降(p0.05)。3.麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠體重、各臟器指數(shù)及肺臟病理變化的影響:(1)麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠體重的影響:與正常對照組比較,流感病毒感染小鼠后,模型對照組體重顯著降低(p0.01)。與模型對照組比較,各藥物治療組小鼠體重顯著升高(p0.01),給藥治療3天的麻杏石甘湯組體重下降抑制率為23.39%;給藥治療7天的麻杏石甘湯組體重下降抑制率為26.68%。(2)麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率的影響:與正常對照組比較,流感病毒感染小鼠后,模型對照組肺指數(shù)顯著升高(p0.01)。與模型對照組比較,各藥物治療組小鼠肺指數(shù)顯著下降(p0.01),給藥治療3天的麻杏石甘湯組肺指數(shù)抑制率為28.67%;給藥治療7天的麻杏石甘湯組肺指數(shù)抑制率為29.47%。(3)麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響:與正常對照組比較,流感病毒感染小鼠后,模型對照組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著下降(p0.01)。與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著升高(p0.01)。(4)麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠肺臟病理變化的影響:正常對照組小鼠肺泡大小正常,肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、細支氣管等組織結(jié)構(gòu)正常,無炎性細胞浸潤;模型對照組小鼠肺泡大小不一致,肺泡囊、肺泡管、肺泡隔、細支氣管等正常結(jié)構(gòu)遭到破壞,有大量的炎細胞浸潤,肺部血管內(nèi)充血;經(jīng)藥物干預(yù)后,麻杏石甘湯組小鼠肺組織炎癥有明顯減輕。4.麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠結(jié)腸病理變化的影響:正常對照組結(jié)腸粘膜上皮完整,腺體排列規(guī)則;間質(zhì)內(nèi)無充血、水腫、炎細胞浸潤;流感病毒進攻機體后,結(jié)腸黏膜上皮水腫、甚至脫落,腺體排列不規(guī)則,黏膜腺體破壞,黏膜內(nèi)充血、水腫,有大量炎細胞浸潤。經(jīng)藥物干預(yù)后,麻杏石甘湯組小鼠結(jié)腸組織炎癥有不同程度的減輕。5.麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠血清中IL-6、MCP-1含量水平的影響:與正常對照組比較,模型對照組小鼠血清中IL-6含量水平顯著上升(p0.01);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組IL-6含量水平不同程度下降,有明顯差異(p0.01或p0.05);給藥治療3天的麻杏石甘湯組IL-6含量水平明顯降低(p0.05)。給藥治療7天的麻杏石甘湯組IL-6含量水平顯著降低(p0.01)。與正常對照組比較,模型對照組小鼠血清中MCP-1含量水平顯著升高(p0.01);與模型對照組相比,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組MCP-1含量水平明顯下降(p0.05)。6.麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠肺組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平的影響:(1)免疫組化法檢測結(jié)果:與正常對照組比較,模型對照組小鼠肺組織中IL-6蛋白表達水平顯著上升(p0.01);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組IL-6蛋白表達水平明顯下降(p0.05)。與正常對照組比較,流感病毒感染小鼠后,模型對照組小鼠肺組織中MCP-1蛋白表達水平顯著升高(p0.01);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組MCP-1蛋白表達水平不同程度降低,有明顯差異(p0.01或p0.05);給藥治療3天的麻杏石甘湯組MCP-1蛋白表達水平明顯下降(p0.05)。給藥治療7天的麻杏石甘湯組MCP-1含量水平顯著降低(p0.01)。(2)Western blotting法檢測結(jié)果:與正常對照組比較,模型對照組小鼠肺組織中IL-6蛋白表達水平顯著升高(p0.01);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組IL-6蛋白表達水平不同程度降低,有明顯差異(p0.01或p0.05);給藥治療3天的麻杏石甘湯組IL-6蛋白表達水平顯著下降(p0.01)。給藥治療7天的麻杏石甘湯組IL-6含量水平明顯降低(p0.05)。與正常對照組比較,模型對照組小鼠肺組織中MCP-1蛋白表達水平顯著升高(p0.01);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組MCP-1蛋白表達水平顯著降低(p0.01)。7.麻杏石甘湯對流感病毒感染小鼠結(jié)腸組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平的影響:與正常對照組相比,模型對照組小鼠結(jié)腸組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平不同程度升高,有明顯差異(p0.01或p0.05);與模型對照組比較,給藥治療3天和給藥治療7天的麻杏石甘湯組小鼠結(jié)腸組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平無明顯差異(p0.05)。8.流感病毒感染小鼠肺指數(shù)與肺組織IL-6、MCP-1蛋白表達水平相關(guān)性分析檢測:給藥治療3天和給藥治療7天的肺指數(shù)與肺組織IL-6蛋白表達水平之間,以及肺指數(shù)與肺組織MCP-1蛋白表達水平之間具有相關(guān)性。9.肺組織與結(jié)腸組織IL-6和MCP-1蛋白表達水平相關(guān)性分析檢測:給藥治療3天的肺組織與結(jié)腸組織IL-6蛋白表達水平之間以及肺組織與結(jié)腸組織MCP-1蛋白表達水平之間具有相關(guān)性。結(jié)論:1.流感病毒攻擊RAW264.7細胞后,病毒能感染并吸附細胞,為研究流感病毒體外實驗建立良好的模型;流感病毒感染RAW264.7細胞后,細胞上清中IL-6、MCP-1含量升高,說明流感病毒進入機體后,引起細胞因子和趨化因子的釋放,而經(jīng)麻杏石甘湯治療后,IL-6、MCP-1含量降低,表明麻杏石甘湯能抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫功能。2.流感病毒感染小鼠后體重下降,肺部嚴(yán)重充血,肺指數(shù)升高,說明小鼠肺部感染模型造模成功,經(jīng)麻杏石甘湯治療后,小鼠體重上升;流感病毒感染小鼠后肺指數(shù)上升,小鼠肺部有明顯炎癥反應(yīng),流感病毒感染小鼠后脾指數(shù)、胸腺指數(shù)下降,說明小鼠免疫器官遭受病理損傷,機體免疫功能下降;經(jīng)麻杏石甘湯治療后,小鼠肺指數(shù)下降,表明麻杏石甘湯能減輕炎癥反應(yīng);經(jīng)麻杏石甘湯治療后,小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)上升,表明麻杏石甘湯對小鼠免疫器官有保護作用。3.流感病毒入侵后,小鼠肺臟正常結(jié)構(gòu)遭到破壞,有大量炎細胞浸潤,經(jīng)藥物治療后,肺部炎癥反應(yīng)減輕;流感病毒入侵后,小鼠結(jié)腸粘膜充血、水腫,甚至粘膜上皮脫落,經(jīng)藥物治療后,結(jié)腸炎癥反應(yīng)減輕。4.流感病毒入侵后,小鼠血清中IL-6、MCP-1含量升高,說明流感病毒進入機體后,引起細胞因子和趨化因子的釋放,經(jīng)麻杏石甘湯治療后,IL-6、MCP-1含量降低,表明麻杏石甘湯能調(diào)節(jié)免疫答應(yīng)。5.流感病毒入侵后,小鼠肺組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平升高,說明流感病毒進入機體后,肺組織中細胞因子和趨化因子增多,經(jīng)麻杏石甘湯治療后,IL-6、MCP-1蛋白表達水平下降,表明麻杏石甘湯能調(diào)節(jié)肺組織中細胞因子和趨化因子的蛋白表達水平,減輕肺部炎癥。6.流感病毒入侵后,小鼠結(jié)腸組織中IL-6、MCP-1蛋白表達水平升高,說明流感病毒進入機體后,結(jié)腸組織中細胞因子和趨化因子增多,經(jīng)麻杏石甘湯治療后,IL-6、MCP-1蛋白表達水平無明顯差異。7.肺指數(shù)與肺組織IL-6、MCP-1蛋白表達水平之間存在相關(guān)關(guān)系;肺組織與結(jié)腸組織IL-6、MCP-1蛋白表達水平之間的相關(guān)性與給藥時間點相關(guān)。8.流感病毒感染后肺部的炎癥有可能擴散,而引起疾病的傳變,其物質(zhì)基礎(chǔ)有可能是炎性細胞因子,課題組還需進一步研究。
【圖文】：

24h 與 48h 的 RAW264.7 細 胞 上 清 中 IL-6 含 量 水 平 顯 著 上 升（ p＜ 0.01）； 病 毒 對 照 組 比 較 ，， 給 藥 治 療 24h、 48h 的 麻 杏 石 甘 湯 組 IL-6 含 量 水 平 顯 下 降 （ p＜ 0.05） 。 5：各 組 RAW264.7 細 胞 上 清 中 IL-6（ pg/ml）含 量 水 平（x s，n＝ 5）組 別 給 藥 24h 給 藥 48h正 常 對 照 組 65.45± 2.95 63.76± 3.78病 毒 對 照 組80.04± 3.39**76.75± 4.55**奧 司 他 韋 組 68.42± 4.47△ △65.89± 3.31△ △麻 杏 石 甘 湯 組 74.27± 2.97△70.98± 2.38△F 值 10.425 10.622P 值 0.000 0.000 ：與 正 常 對 照 組 比 較 ，**p＜ 0.01；與 模 型 對 照 組 比 較 ，△ △ p＜ 0.01， p＜ 0.05。

各組RAW264.7細胞上清中MCP-1含量水平
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：2615274