【摘要】：目的通過(guò)動(dòng)物心梗模型驗(yàn)證辛溫通陽(yáng)法的代表藥物蔥白提取物防治心梗后室性心律失常的療效,初步闡明蔥白提取物作用機(jī)制;利用芯片篩選可逆性差異性微小RNA并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶蛋白,進(jìn)一步明確蔥白提取物治療心梗后室性心律失常的微小RNA調(diào)控機(jī)制。方法本研究選用體重為250-300克,3-4月齡的健康純種SD雄性大白鼠,隨機(jī)分為預(yù)防組和治療組。預(yù)防組(A-L)分為:假手術(shù)組、空白模型組、蔥白組、蔥白提取物組和胺碘酮片組,每組15只;治療組分為急性組(1周)和慢性組(4周),每組又分為假手術(shù)組、空白模型組、蔥白組、蔥白提取物組和胺碘酮片組,每組15只。行腹腔注射麻醉,上呼吸機(jī),開(kāi)胸,暴露心臟,絲線圍繞左前降支結(jié)扎,直至所在范圍內(nèi)的心肌明顯腫脹、變暗、無(wú)收縮運(yùn)動(dòng),心電監(jiān)護(hù)示ST段抬高0.5mV,且30min內(nèi)不回落,示心肌梗死模型制備成功。預(yù)防組大鼠麻醉后連接體表心電圖,造模成功后,設(shè)置刺激電極,進(jìn)行程序電刺激誘發(fā)室性心律失常;治療組分別于給藥結(jié)束后,大鼠麻醉后連接體表心電圖,開(kāi)胸,設(shè)置刺激電極,進(jìn)行程序電刺激誘發(fā)室性心律失常。預(yù)防組連續(xù)給藥1w后建立心梗模型;治療組建立心梗模型后,從術(shù)后第二天開(kāi)始灌胃給藥。急性組連續(xù)給藥1w,慢性組連續(xù)給藥4w。治療結(jié)束后在體誘發(fā)心律失常,記錄所發(fā)生的室性心律失常的種類。比較各組之間心律失常評(píng)分,進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。采用微小RNA芯片比較預(yù)防組和治療組共20只SD大鼠心肌細(xì)胞的miRs差異性表達(dá),給予藥物處理后恢復(fù)原來(lái)表達(dá)譜。列出可逆性差異miRs表達(dá)譜。設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,QRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證上述可逆性差異性表達(dá)的miRs。用TargetScan和PicTar工具,預(yù)測(cè)miRs靶蛋白,根據(jù)蛋白功能,建立蔥白提取物-miRNA-mRNA蛋白通路,利用luciferase實(shí)驗(yàn)在HEK293細(xì)胞中驗(yàn)證miRs同靶蛋白的序列特異性,上調(diào)和/或下調(diào)相應(yīng)miRs,在心肌細(xì)胞中檢測(cè)其蛋白表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果1.預(yù)防給藥實(shí)驗(yàn)中,與空白模型組比較,蔥白組大鼠VP、VT及胺碘酮片組大鼠VT、VF的發(fā)生例數(shù)無(wú)顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常的發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長(zhǎng)心律失常發(fā)生時(shí)間,減少持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率(P0.01),胺碘酮片組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠ST段抬高程度及Mest評(píng)分無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可降低ST段抬高程度及Mest評(píng)分(P0.05),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。急性給藥實(shí)驗(yàn)中,與空白模型組比較,蔥白組及胺碘酮片組VT、VF的發(fā)生例數(shù)無(wú)顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長(zhǎng)心律失常發(fā)生時(shí)間,減少持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長(zhǎng)心律失常發(fā)生時(shí)間,減少持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率(P0.01)。慢性給藥實(shí)驗(yàn)中,與空白模型組比較,蔥白組及胺碘酮片組VP、VF的發(fā)生例數(shù)無(wú)顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長(zhǎng)心律失常發(fā)生時(shí)間,減少持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間及發(fā)生率無(wú)顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長(zhǎng)心律失常發(fā)生時(shí)間,減少持續(xù)時(shí)間和發(fā)生率(P0.01)。2.運(yùn)用miRNA芯片,我們列出了10對(duì)蔥白提取物處理心梗后大鼠心肌細(xì)胞和無(wú)蔥白提取物處理對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)譜。散點(diǎn)圖可被用于蔥白提取物處理組和無(wú)蔥白提取物處理組中的miRNAs不同表達(dá)的視覺(jué)評(píng)估。圖中X軸和Y軸的值代表兩組樣本信號(hào)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的平均值(log2縮放),綠色直線為倍數(shù)變化線。圖中央的綠線代表倍數(shù)變化(Fold Change)為1倍,表示兩組樣本之間無(wú)差異。位于最上方綠色直線以上和最下方綠色直線以下的miRNAs,表示其在兩組樣本之間的倍數(shù)變化大于1.5倍。散點(diǎn)圖用于篩選出倍數(shù)變化在1.5倍以上的一般數(shù)據(jù)。火山圖可被用于顯示倍數(shù)變化和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之間的關(guān)系,更為直觀的顯示了蔥白提取物處理組和無(wú)蔥白提取物處理組之間miRNAs表達(dá)的顯著差異。兩條垂直綠線分別表示上調(diào)或者下調(diào)1.5倍,水平綠線表示P值為0.05,紅色標(biāo)識(shí)表示差異在1.5倍以上,且P值小于0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNAs。mi RNAs芯片篩選出蔥白提取物處理組大鼠心肌細(xì)胞中可逆性恢復(fù)的67個(gè)具有顯著表達(dá)差異的miRNAs(FC1.5,P0.05)。其中,分別有16個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),51個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。上調(diào)最明顯的miR-21及下調(diào)最明顯的miR-15b-5p作為后續(xù)驗(yàn)證對(duì)象。在qRT-PCR對(duì)15組樣本的驗(yàn)證中,與未使用蔥白提取物的對(duì)照組相比,蔥白提取物組大鼠心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)均顯著減少(p0.05),miR-21表達(dá)均顯著增加(p0.05)。miR-15b-5p及miR-21的表達(dá)水平均與其在miRNAs芯片中的表達(dá)趨勢(shì)相一致。3.基于TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(7.0版)找出了與心律失常相關(guān)的miR-15b-5p的靶基因WNT3A以及miR-21的靶基因TGFβR2(圖3.1)。在HEK293細(xì)胞中,分別過(guò)表達(dá)miR-15b-5p及miR-21,檢測(cè)它們對(duì)含靶基因3’UTR的報(bào)告基因抑制情況。其中,miR-15b-5p明顯抑制含有野生型(WT)WNT3A基因的3’UTR的報(bào)告基因表達(dá)(P0.01),而對(duì)突變型(Mut)WNT3A基因的3’UTR的報(bào)告基因表達(dá)無(wú)明顯差異;同樣的,miR-21明顯抑制含有野生型(WT)TGFβR2基因的3’UTR的報(bào)告基因表達(dá)(P0.01),而對(duì)突變型(Mut)TGFβR2基因的3’UTR的報(bào)告基因表達(dá)無(wú)明顯差異。在大鼠心梗后心肌細(xì)胞中分別敲低miR-15b-5p及過(guò)表達(dá)mi R-21后,與對(duì)照組相比,miR-15b-5p敲低組靶蛋白WNT3A表達(dá)水平上升,miR-21過(guò)表達(dá)組靶蛋白TGFβR2表達(dá)水平下降。結(jié)論1.辛溫通陽(yáng)中藥蔥白提取物可通過(guò)影響大鼠模型心梗后室性心律失常的發(fā)生類型、發(fā)生及持續(xù)時(shí)間、發(fā)生率和ST段抬高程度進(jìn)而改善心梗后室性心律失常的發(fā)生發(fā)展。2.蔥白提取物防治急性心肌梗死后室性心律失常的微小RNA作用機(jī)制主要與調(diào)節(jié)miR-15b-5p及mi R-21的表達(dá)有關(guān),可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin及TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。
【圖文】：

圖2.1 miRNAs差異散點(diǎn)圖（數(shù)據(jù)歸一化；X軸：非蔥白提取物對(duì)照組；Y軸：蔥白提取物處理組；綠色直線代表倍數(shù)變化，miRNAs位于最上方綠色直線以上和最下方綠色直線以下的，，表示其在兩組樣本之間的倍數(shù)變化大于1.5倍）。2.2 QRT-PCR驗(yàn)證miR-21及miR-15b-5p表達(dá)水平 15對(duì)驗(yàn)證樣本中，與未使用蔥白提取物的對(duì)照組相比，蔥白提取物組大鼠心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)均顯著減少（p＜0.05，圖2.3A和C），miR-21表達(dá)均顯著增加（p＜0.05，圖2.3B和C）。miR-15b-5p及miR-21的表達(dá)水平均與其在miRNAs芯片中的表達(dá)趨勢(shì)相一致。

圖2.2 miRNAs差異分布火山圖（X軸：倍數(shù)變化；Y：P值；垂直綠線相當(dāng)于1.5倍上調(diào)或者下調(diào)，水平綠線代表P值為0.05；圖中紅點(diǎn)代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNAs差異表達(dá)，即FC＞1.5，P＜0.05）。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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4 丁e醵

本文編號(hào)：2615240