【摘要】：目的通過動物心梗模型驗證辛溫通陽法的代表藥物蔥白提取物防治心梗后室性心律失常的療效,初步闡明蔥白提取物作用機制;利用芯片篩選可逆性差異性微小RNA并結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測靶蛋白,進(jìn)一步明確蔥白提取物治療心梗后室性心律失常的微小RNA調(diào)控機制。方法本研究選用體重為250-300克,3-4月齡的健康純種SD雄性大白鼠,隨機分為預(yù)防組和治療組。預(yù)防組(A-L)分為:假手術(shù)組、空白模型組、蔥白組、蔥白提取物組和胺碘酮片組,每組15只;治療組分為急性組(1周)和慢性組(4周),每組又分為假手術(shù)組、空白模型組、蔥白組、蔥白提取物組和胺碘酮片組,每組15只。行腹腔注射麻醉,上呼吸機,開胸,暴露心臟,絲線圍繞左前降支結(jié)扎,直至所在范圍內(nèi)的心肌明顯腫脹、變暗、無收縮運動,心電監(jiān)護(hù)示ST段抬高0.5mV,且30min內(nèi)不回落,示心肌梗死模型制備成功。預(yù)防組大鼠麻醉后連接體表心電圖,造模成功后,設(shè)置刺激電極,進(jìn)行程序電刺激誘發(fā)室性心律失常;治療組分別于給藥結(jié)束后,大鼠麻醉后連接體表心電圖,開胸,設(shè)置刺激電極,進(jìn)行程序電刺激誘發(fā)室性心律失常。預(yù)防組連續(xù)給藥1w后建立心梗模型;治療組建立心梗模型后,從術(shù)后第二天開始灌胃給藥。急性組連續(xù)給藥1w,慢性組連續(xù)給藥4w。治療結(jié)束后在體誘發(fā)心律失常,記錄所發(fā)生的室性心律失常的種類。比較各組之間心律失常評分,進(jìn)行療效評價。采用微小RNA芯片比較預(yù)防組和治療組共20只SD大鼠心肌細(xì)胞的miRs差異性表達(dá),給予藥物處理后恢復(fù)原來表達(dá)譜。列出可逆性差異miRs表達(dá)譜。設(shè)計相應(yīng)引物,QRT-PCR進(jìn)一步驗證上述可逆性差異性表達(dá)的miRs。用TargetScan和PicTar工具,預(yù)測miRs靶蛋白,根據(jù)蛋白功能,建立蔥白提取物-miRNA-mRNA蛋白通路,利用luciferase實驗在HEK293細(xì)胞中驗證miRs同靶蛋白的序列特異性,上調(diào)和/或下調(diào)相應(yīng)miRs,在心肌細(xì)胞中檢測其蛋白表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果1.預(yù)防給藥實驗中,與空白模型組比較,蔥白組大鼠VP、VT及胺碘酮片組大鼠VT、VF的發(fā)生例數(shù)無顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常的發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時間、持續(xù)時間及發(fā)生率無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長心律失常發(fā)生時間,減少持續(xù)時間和發(fā)生率(P0.01),胺碘酮片組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠ST段抬高程度及Mest評分無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可降低ST段抬高程度及Mest評分(P0.05),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。急性給藥實驗中,與空白模型組比較,蔥白組及胺碘酮片組VT、VF的發(fā)生例數(shù)無顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時間、持續(xù)時間及發(fā)生率無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長心律失常發(fā)生時間,減少持續(xù)時間和發(fā)生率(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時間、持續(xù)時間及發(fā)生率無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長心律失常發(fā)生時間,減少持續(xù)時間和發(fā)生率(P0.01)。慢性給藥實驗中,與空白模型組比較,蔥白組及胺碘酮片組VP、VF的發(fā)生例數(shù)無顯著性差異(P0.05),其余各治療組均可降低心梗后大鼠心律失常發(fā)生例數(shù)(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時間、持續(xù)時間及發(fā)生率無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長心律失常發(fā)生時間,減少持續(xù)時間和發(fā)生率(P0.01),蔥白提取物組效果最為顯著(P0.01)。與空白模型組比較,蔥白組大鼠心律失常的發(fā)生時間、持續(xù)時間及發(fā)生率無顯著性差異(P0.05),蔥白提取物組和胺碘酮片組均可延長心律失常發(fā)生時間,減少持續(xù)時間和發(fā)生率(P0.01)。2.運用miRNA芯片,我們列出了10對蔥白提取物處理心梗后大鼠心肌細(xì)胞和無蔥白提取物處理對照組大鼠心肌細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)譜。散點圖可被用于蔥白提取物處理組和無蔥白提取物處理組中的miRNAs不同表達(dá)的視覺評估。圖中X軸和Y軸的值代表兩組樣本信號經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的平均值(log2縮放),綠色直線為倍數(shù)變化線。圖中央的綠線代表倍數(shù)變化(Fold Change)為1倍,表示兩組樣本之間無差異。位于最上方綠色直線以上和最下方綠色直線以下的miRNAs,表示其在兩組樣本之間的倍數(shù)變化大于1.5倍。散點圖用于篩選出倍數(shù)變化在1.5倍以上的一般數(shù)據(jù)�；鹕綀D可被用于顯示倍數(shù)變化和統(tǒng)計學(xué)意義之間的關(guān)系,更為直觀的顯示了蔥白提取物處理組和無蔥白提取物處理組之間miRNAs表達(dá)的顯著差異。兩條垂直綠線分別表示上調(diào)或者下調(diào)1.5倍,水平綠線表示P值為0.05,紅色標(biāo)識表示差異在1.5倍以上,且P值小于0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNAs。mi RNAs芯片篩選出蔥白提取物處理組大鼠心肌細(xì)胞中可逆性恢復(fù)的67個具有顯著表達(dá)差異的miRNAs(FC1.5,P0.05)。其中,分別有16個miRNAs表達(dá)上調(diào),51個miRNAs表達(dá)下調(diào)。上調(diào)最明顯的miR-21及下調(diào)最明顯的miR-15b-5p作為后續(xù)驗證對象。在qRT-PCR對15組樣本的驗證中,與未使用蔥白提取物的對照組相比,蔥白提取物組大鼠心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)均顯著減少(p0.05),miR-21表達(dá)均顯著增加(p0.05)。miR-15b-5p及miR-21的表達(dá)水平均與其在miRNAs芯片中的表達(dá)趨勢相一致。3.基于TargetScan數(shù)據(jù)庫(7.0版)找出了與心律失常相關(guān)的miR-15b-5p的靶基因WNT3A以及miR-21的靶基因TGFβR2(圖3.1)。在HEK293細(xì)胞中,分別過表達(dá)miR-15b-5p及miR-21,檢測它們對含靶基因3’UTR的報告基因抑制情況。其中,miR-15b-5p明顯抑制含有野生型(WT)WNT3A基因的3’UTR的報告基因表達(dá)(P0.01),而對突變型(Mut)WNT3A基因的3’UTR的報告基因表達(dá)無明顯差異;同樣的,miR-21明顯抑制含有野生型(WT)TGFβR2基因的3’UTR的報告基因表達(dá)(P0.01),而對突變型(Mut)TGFβR2基因的3’UTR的報告基因表達(dá)無明顯差異。在大鼠心梗后心肌細(xì)胞中分別敲低miR-15b-5p及過表達(dá)mi R-21后,與對照組相比,miR-15b-5p敲低組靶蛋白WNT3A表達(dá)水平上升,miR-21過表達(dá)組靶蛋白TGFβR2表達(dá)水平下降。結(jié)論1.辛溫通陽中藥蔥白提取物可通過影響大鼠模型心梗后室性心律失常的發(fā)生類型、發(fā)生及持續(xù)時間、發(fā)生率和ST段抬高程度進(jìn)而改善心梗后室性心律失常的發(fā)生發(fā)展。2.蔥白提取物防治急性心肌梗死后室性心律失常的微小RNA作用機制主要與調(diào)節(jié)miR-15b-5p及mi R-21的表達(dá)有關(guān),可能通過影響Wnt/β-catenin及TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),其具體的調(diào)控機制有待進(jìn)一步的深入研究。
【圖文】：

圖2.1 miRNAs差異散點圖（數(shù)據(jù)歸一化；X軸：非蔥白提取物對照組；Y軸：蔥白提取物處理組；綠色直線代表倍數(shù)變化，miRNAs位于最上方綠色直線以上和最下方綠色直線以下的，，表示其在兩組樣本之間的倍數(shù)變化大于1.5倍）。2.2 QRT-PCR驗證miR-21及miR-15b-5p表達(dá)水平 15對驗證樣本中，與未使用蔥白提取物的對照組相比，蔥白提取物組大鼠心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)均顯著減少（p＜0.05，圖2.3A和C），miR-21表達(dá)均顯著增加（p＜0.05，圖2.3B和C）。miR-15b-5p及miR-21的表達(dá)水平均與其在miRNAs芯片中的表達(dá)趨勢相一致。

圖2.2 miRNAs差異分布火山圖（X軸：倍數(shù)變化；Y：P值；垂直綠線相當(dāng)于1.5倍上調(diào)或者下調(diào)，水平綠線代表P值為0.05；圖中紅點代表有統(tǒng)計學(xué)意義的miRNAs差異表達(dá)，即FC＞1.5，P＜0.05）。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2615240