【摘要】：肝纖維化是肝臟對各種致病因素導致的急性或慢性損傷進行的可逆性修復過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起到至關重要的作用,表現(xiàn)為HSCs由靜止狀態(tài)被激活并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細胞,隨后肌成纖維樣細胞大量增殖并過度合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),導致細胞外基質(zhì)過度沉積。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是最重要的致纖維化細胞因子,TGF-β1不但可以直接激活HSCs引起Ι型膠原及其他基質(zhì)組分合成增加,還可以通過TGF-β/Smad信號通路促進ECM的生成和沉積,使肝細胞受損后不能再生。CD36屬于B族清道夫受體,在哺乳動物體內(nèi)的多種細胞表面廣泛表達,介導長鏈脂肪酸(fatty acids,FA)的攝取。CD36在正常肝內(nèi)皮和間質(zhì)細胞及庫弗氏細胞中低表達,但是可以在禁食或某些轉(zhuǎn)錄因子被激活時被誘導高表達,從而增加肝臟對脂肪酸的攝取和甘油三酯的聚集。自噬參與HSCs激活,通過分解受損細胞器,自噬可以為HSCs活化提供能量,促進HSCs的活化及纖維化的發(fā)展;自噬還能夠通過分解肝細胞內(nèi)脂滴參與脂質(zhì)代謝,從而減輕肝臟炎癥。人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd)為人參提取物中的稀有單體皂苷,有很強的生物學活性,在保護心腦血管、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及創(chuàng)傷修復等方面發(fā)揮獨到的藥理學作用。但人參皂苷Rd是否具有抗纖維化作用還鮮有研究。為此,本研究采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化HSCs為模型,探討人參皂苷Rd在肝纖維化中的作用及其相關機制,為人參皂苷Rd成藥提供思路。方法1 MTT法檢測人參皂苷Rd對HSCs活力和增殖的影響96孔板中接種細胞,每組6個復孔。12小時后加藥處理,繼續(xù)培養(yǎng)24小時和48小時后加入MTT工作液,再繼續(xù)培養(yǎng)4小時后加入DMSO終止液,搖勻后492 nm測吸光度值。2 ox-LDL活化HSCs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞株HSC-T6,待細胞長至培養(yǎng)瓶底面積80%時,消化細胞并接種24孔板,12小時后加入10μg/ml ox-LDL,繼續(xù)培養(yǎng)48小時。3實驗分組及加藥處理實驗分為4組:空白對照組、模型組、低劑量組、高劑量組;按照每孔2.5×105個細胞接種12孔板,12小時后按上述分組依次加入PBS、10μg/ml ox-LDL、10μg/ml ox-LDL+20μmol/L Rd、10μg/ml ox-LDL+40μmol/L Rd,繼續(xù)培養(yǎng)48小時。4膽固醇氧化酶終點法檢測HSCs總膽固醇含量細胞培養(yǎng)及加藥處理后,離心收集細胞沉淀并分成兩份,采用RIPA裂解液提取總蛋白和異丙醇加超聲提取總膽固醇;采用BCA法測定蛋白總濃度,使用膽固醇(CHO酶法)試劑盒測定總膽固醇含量;以各分組細胞總膽固醇/各分組細胞總蛋白(mg/g)作為各分組細胞總膽固醇含量的比較。5油紅染色法觀察HSCs脂質(zhì)攝入6孔板中細胞爬片及加藥處理,4%多聚甲醛固定細胞,去離子水洗片,加入油紅工作液避光染色,60%異丙醇漂洗后去離子水洗凈,顯微鏡下觀察拍照。6免疫熒光檢測HSCs膠原蛋白表達6孔板中細胞爬片及加藥處理,4%多聚甲醛固定細胞,免疫染色封閉液室溫封閉,滴加Anti-Collagen I抗體后于保濕盒中4℃避光孵育過夜;加入FITC標記羊抗兔IgG,室溫避光孵育后DAPI染色,避光漂洗后加入抗熒光淬滅封片液,倒置熒光顯微鏡觀察拍照。7 RT-PCR法檢測HSCs mRNA表達總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,分光光度計測定RNA總濃度,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;Real-time PCR檢測TGF-β1和CD36 m RNA表達;使用大鼠GAPDH作為內(nèi)參,以2~(-ΔΔCt)法計算各目的基因的相對表達量。8 Western blot檢測HSCs蛋白表達RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白總濃度。SDS-PAGE分離樣品蛋白后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉,4℃過夜孵育各蛋白抗體:CD36,collagen type I(COL1A1),Smad2,Smad4,LC3Ⅱ,GAPDH;室溫孵育二抗工作液;使用ECL發(fā)光液顯影并曝光膠片,Quantity One分析軟件進行條帶灰度分析,各目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達量。結(jié)果1 MTT實驗結(jié)果顯示,人參皂苷Rd在濃度低于40μM時對HSCs活力無影響;模型組的HSCs在培養(yǎng)24小時后略有增殖,但與空白對照組比較沒有明顯差異;低劑量組和高劑量組顯著抑制HSCs增殖(p0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義;培養(yǎng)48小時后,模型組細胞增殖明顯上升(p0.05),而低劑量組和高劑量組明顯抑制HSCs增殖(低劑量組:P0.05;高劑量組:P0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義。2 ox-LDL在10μg/ml時最大限度地持續(xù)活化HSCs,使其TGF-β1 m RNA表達和COL1A1蛋白表達顯著上升(TGF-β1:P0.01;COL1A1:P0.05),與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義。3酶法檢測HSCs總膽固醇含量結(jié)果顯示,模型組細胞內(nèi)膽固醇含量顯著升高(P0.01),與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義;人參皂苷Rd處理后,低劑量組細胞內(nèi)膽固醇含量變化不明顯,而高劑量組細胞內(nèi)膽固醇含量明顯降低(P0.05),與模型組比較有統(tǒng)計學意義。4油紅染色結(jié)果顯示,ox-LDL處理HSCs后,模型組細胞內(nèi)脂滴蓄積,脂滴數(shù)量和含量均明顯高于空白對照組;人參皂苷Rd處理后,與模型組比較,低劑量組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量略有減少,而高劑量組細胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著減少。5免疫熒光染色結(jié)果顯示,模型組表達COL1A1蛋白的細胞數(shù)量和熒光強度均明顯高于空白對照組;人參皂苷Rd處理后,與模型組比較,低劑量組細胞的熒光強度稍有降低,而高劑量組表達COL1A1蛋白的細胞數(shù)量和熒光強度均顯著降低。6 HSCs活化后,模型組CD36 mRNA表達顯著升高(P0.01),與空白對照組比較有統(tǒng)計學意義;低劑量組和高劑量組的CD36 m RNA表達顯著升高(P0.01),與空白對照組和模型組比較均有統(tǒng)計學意義。7 ox-LDL活化HSCs后,模型組COL1A1蛋白、CD36蛋白、LC3Ⅱ蛋白表達均明顯升高(COL1A1:P0.05;CD36:P0.01;LC3Ⅱ:P0.05),與空白對照組比較均有統(tǒng)計學意義;模型組Smad2蛋白表達略有下降,Smad4蛋白表達有所增加,與空白對照組比較均無統(tǒng)計學差異。人參皂苷Rd處理后,低劑量組和高劑量組COL1A1蛋白表達均明顯降低(低劑量組:P0.05;高劑量組:P0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義;低劑量組CD36蛋白改變不明顯,而高劑量組CD36蛋白表達顯著降低(P0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義;低劑量和高劑量組Smad2蛋白表達均無明顯改變,但高劑量組Samd4蛋白表達顯著降低(p0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義;低劑量組和高劑量組LC3Ⅱ蛋白表達均明顯降低(低劑量組:P0.05;高劑量組:P0.01),與模型組比較有統(tǒng)計學意義。結(jié)論1.低濃度ox-LDL可以持續(xù)活化HSCs,使HSCs TGF-β1 m RNA表達和COL1A1蛋白表達顯著升高。2.人參皂苷Rd可能通過抑制CD36蛋白表達及減少脂質(zhì)攝入來抑制活化的HSCs增殖和COL1A1蛋白表達而具有抗纖維化的作用。3.人參皂苷Rd可能通過抑制TGF-β/Smad通路并降低細胞自噬對ox-LDL活化HSCs有抑制作用。
【圖文】：

圖 1 人參皂苷 Rd 對 HSCs 活力的影響** P<0.01，與空白對照組比較。表 2 人參皂苷 Rd 對 HSCs 活力的影響（ ±s，n=6）空白組 溶劑組 Rd100 Rd80 Rd60 Rd40 Rd20

圖 2 人參皂苷 Rd 對 HSCs 活力的影響** P<0.01，，與空白對照組比較。2.2.1.2 人參皂苷 Rd 對 HSCs 活化后增殖的影響MTT 法檢測 HSCs 活化后的增殖結(jié)果顯示，24 小時后，模型組細胞增殖與空
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 侯艷鋒;李暉;梁穎丹;胥展志;江婷;;肝纖維化動物模型研究進展[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2015年01期

2 劉德育;曾颯;;從三七藥材中快速批量分離提取人參皂苷Rd的方法[J];中藥材;2006年03期

3 劉尚喜,陳瑗,周玫;氧化LDL的不同組分在抑制巨噬細胞釋放NO中的作用[J];生物化學與生物物理學報;1997年04期

4 劉尚喜，周玫，陳瑗，孫曼霽;低密度脂蛋白氧化修飾過程中脂氫過氧化物的變化及外源性抗氧化劑的影響[J];第一軍醫(yī)大學學報;1996年04期

本文編號：2614777