【摘要】：目的:淫羊藿苷(Icariin,ICA)是從淫羊藿總黃酮(EFs)中提取的主要活性化合物,參與許多種類細胞的細胞行為(增殖,凋亡和自噬等)的調(diào)節(jié),但淫羊藿苷對氣道平滑肌細胞(ASMCs)的作用尚未在國內(nèi)外進行研究。本實驗旨在研究淫羊藿苷對大鼠ASMCs增殖,凋亡和自噬的作用。方法:實驗通過麻醉SD大鼠,分離其氣道,用組織貼塊法及差速貼壁法提取和純化大鼠ASMCs,并通過平滑肌α-肌動蛋白(SMα-肌動蛋白)熒光對細胞純度進行鑒定。細胞增殖/毒性檢測試劑盒(CCK-8)及Edu增殖試劑盒檢測大鼠ASMCs在不同濃度和不同處理時間的ICA作用下其細胞增殖情況。通過流式細胞術(shù)分析細胞周期。通過流式細胞術(shù)和TdT-UTP缺口末端標記(TUNEL)測定法檢測細胞凋亡。Western blot檢測細胞內(nèi)cyclinE1,cyclinA1及Caspase-3,LC3蛋白的表達。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測cyclinE1,cyclinA1,Atg3,Atg5和Beclin1 mRNA的表達。結(jié)果:通過組織貼塊法成功提取大鼠ASMCs,經(jīng)熒光鑒定純度在95%以上。CCK-8及Edu檢測顯示淫羊藿苷以時間-劑量依耐性的方式從濃度75μM開始明顯抑制大鼠ASMCs的增殖(P0.01)。流式細胞儀檢測顯示淫羊藿苷干擾ASMCs細胞周期,淫羊藿苷處理時,細胞的S期縮短,G2期延長,cyclin E1和cyclinA1 mRNA和蛋白質(zhì)表達下降。表明淫羊藿苷通過下調(diào)cyclin E1和cyclinA1的表達,影響細胞周期,抑制細胞增殖。Flow Cytometey和TUNEL檢測細胞凋亡顯示淫羊藿苷促進大鼠ASMCs凋亡,濃度為200μM時最為明顯(P0.01)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可激活凋亡蛋白caspase-3的表達,表明淫羊藿苷可能是通過激活caspase-3相關(guān)通路誘導(dǎo)細胞凋亡。最后通過RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷上調(diào)自噬相關(guān)因子Atg3,Atg5和Beclin1的mRNA的表達,并促使LC3Ⅰ激活轉(zhuǎn)化為LC3II,實驗表明淫羊藿苷可能通過影響自噬相關(guān)因子誘導(dǎo)大鼠ASMCs自噬。結(jié)論:淫羊藿苷抑制ASMCs增殖,干擾細胞周期,其作用可能與下調(diào)CyclinA1和CyclinE1的表達有關(guān);并能誘導(dǎo)細胞凋亡,激活casepase凋亡相關(guān)途徑;除此之外還可通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)因子表達誘導(dǎo)細胞自噬。實驗表明淫羊藿苷可影響大鼠ASMCs細胞行為。
【圖文】：

儀器prague Dawley）雌性大鼠，6-8 周齡，體PF 級實驗動物中心提供。及配置ICA，純度≥ 98％）購自上海源生物技術(shù) 1 所示。將 ICA 用二甲基亞砜（DMSO）0℃保存，長時間保存可置于-80℃，注意

結(jié)果 大鼠 ASMCs 在光鏡下的生長特點采用組織塊貼壁法提取大鼠 ASMCs，可見在培養(yǎng)第 4、5 天左并在顯微鏡下觀察到細胞開始從組織塊周圍爬出，補液后 3-4 天底，呈現(xiàn)“峰-谷”結(jié)構(gòu)（圖 2，A）。根據(jù)細胞貼壁時間的差異速貼壁法純化后，，可見細胞呈現(xiàn)梭形星型，多邊形等（圖 2，
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2614518