【摘要】：目的:殘黃片是由黃連、青黛、白礬、郁金4味藥組成的中藥復(fù)方制劑,是解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心用于治療慢性肝炎伴隨的黃疸持久不退——?dú)埩酎S疸的臨床專(zhuān)用藥,擁有四十余年的應(yīng)用歷史,退黃作用確切。目前,對(duì)該方退黃作用機(jī)制尚不明確,且方中青黛和白礬比重懸殊,在制備過(guò)程中對(duì)藥粉的均勻性和成型片劑的質(zhì)量尚有影響。本研究以解決該品存在的制劑問(wèn)題和探索其退黃作用機(jī)制為目的,為保障該品質(zhì)量并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。方法:(1)殘黃片制備工藝的優(yōu)化:篩選方中單藥的最佳超微粉碎工藝,依據(jù)結(jié)果結(jié)合中藥復(fù)合粒子制備方法設(shè)計(jì)3種殘黃片超微粉碎工藝并根據(jù)粉碎時(shí)間和粒徑分布關(guān)系進(jìn)行優(yōu)化篩選,確定3種工藝的最佳制備條件。進(jìn)而考察3個(gè)粉碎工藝制備的藥粉粒徑分布、比表面積、松密度、振密度和休止角,并進(jìn)行電鏡掃描形態(tài)分析和差示量熱法考察粉體熱穩(wěn)定性,綜合對(duì)比3種工藝藥粉的特性。在此基礎(chǔ)上制備不同粉碎工藝殘黃片和原粉碎工藝殘黃片各3個(gè)批次,考察不同工藝下的殘黃片成型中間體的得率,并對(duì)成品進(jìn)行高溫、高濕和強(qiáng)光影響因素試驗(yàn),考察片劑的外觀(guān)、片重差、崩解時(shí)限、脆碎度和小檗堿含量,評(píng)價(jià)不同粉碎工藝對(duì)殘黃片質(zhì)量穩(wěn)定性的提升貢獻(xiàn),篩選出殘黃片最佳粉碎工藝。(2)基于分子對(duì)接技術(shù)的殘黃片退黃作用機(jī)制研究:首先從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)中搜集方中黃連、青黛、郁金的成分,設(shè)定口服吸收利用度≥30%、相對(duì)分子質(zhì)量≤500、氫鍵供體數(shù)目≤5、氫鍵受體數(shù)目≤10、脂水分配系數(shù)不大于5為條件篩選類(lèi)藥成分,Discovery Studio 2016(DS 2016)軟件對(duì)每個(gè)類(lèi)藥成分進(jìn)行加氫,賦予CHARMm力場(chǎng),定義為分子對(duì)接配體。黃疸治療相關(guān)靶點(diǎn)從CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ctdbase.org/)以“jaundice”、“cholestatic liver disease”為關(guān)鍵詞獲取黃疸相關(guān)基因,并輸入到Drug-Bank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)中查詢(xún)已上市藥物的作用靶點(diǎn)及其PDB ID,再?gòu)腜DB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中以ID下載治療黃疸相關(guān)靶蛋白,DS 2016軟件刪去原配體以及水分子,去多構(gòu)象,補(bǔ)充氨基酸殘基,加氫,定義為分子對(duì)接受體。運(yùn)用DS 2016軟件LibDock模塊設(shè)定對(duì)接參數(shù),max hits to save為200、max number of hits為1000、minimum LibDock score為105、conformation method為FAST,將定義的配體成分與受體一一對(duì)接評(píng)價(jià),結(jié)果以L(fǎng)ibDock score打分函數(shù)給出。對(duì)LibDock score大于105的成分-靶點(diǎn)名稱(chēng)進(jìn)行規(guī)范化,將成分-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)對(duì)導(dǎo)入Gephi 0.9.2軟件,Fruchterman-Reingold布局,刻畫(huà)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò),經(jīng)其數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)模塊分析網(wǎng)絡(luò)的密度、介數(shù)和平均路徑,評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性,明確對(duì)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性有重要貢獻(xiàn)的殘黃片成分和靶點(diǎn),并以靶點(diǎn)功能分類(lèi)闡述殘黃片退黃作用機(jī)制。(3)殘黃片對(duì)ANIT誘導(dǎo)黃疸模型大鼠的退黃作用機(jī)制研究:正常組以10 mL·kg~(-1)·d~(-1)灌胃生理鹽水連續(xù)7天,大豆油10 mL·kg~(-1)灌胃模擬造模。模型組以10 mL·kg~(-1)·d~(-1)灌胃生理鹽水連續(xù)7天,α-萘異硫氰酸酯(ANIT)75 mg·kg~(-1)的大豆油溶液灌胃造模。殘黃片(CHP)組以0.315 g·kg~(-1)·d~(-1)劑量灌胃工藝優(yōu)化殘黃片連續(xù)7天,ANIT以75 mg·kg~(-1)的大豆油溶液灌胃造模。殘黃片高劑量(CHP高)組以0.710 g·kg~(-1)·d~(-1)劑量灌胃工藝優(yōu)化殘黃片連續(xù)7天,ANIT以75 mg·kg~(-1)的大豆油溶液灌胃造模。原殘黃片(原CHP)組以0.315 g·kg~(-1)·d~(-1)劑量灌胃原工藝殘黃片連續(xù)7天,ANIT以75 mg·kg~(-1)的大豆油溶液灌胃造模。熊去氧膽酸(UDCA)組以0.135 g·kg~(-1)·d~(-1)劑量灌胃熊去氧膽酸片連續(xù)7天,ANIT以75 mg·kg~(-1)的大豆油溶液灌胃造模。各組大鼠于第5 d給藥2 h后,模型組、CHP組、UDCA組灌胃ANIT復(fù)制黃疸模型,正常組灌胃等體積大豆油模擬造模,于第7 d給藥2 h后腹腔注射20%烏來(lái)糖(20 mL·kg~(-1))溶液麻醉,腹主動(dòng)脈采血,采集肝和回腸組織。工藝優(yōu)化前后殘黃片退黃保肝作用的比較:通過(guò)檢測(cè)血清總膽紅素(TBIL)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)水平,比較工藝優(yōu)化殘黃片和原粉碎工藝殘黃片的退黃保肝作用,確定機(jī)制研究組別。并進(jìn)行HE染色觀(guān)察大鼠肝組織病變情況。膽汁肝腸循環(huán)角度開(kāi)展退黃機(jī)制研究:RT-PCR檢測(cè)肝組織法尼醇X受體(FXR)、孕烷X受體(PXR)、組成性雄烷受體(CAR)、膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1)、膽汁酸鹽外排蛋白(BSEP)、多耐藥相關(guān)蛋白2(MRP2)、Na~+-�；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)體(NTCP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1A1(OATP1A1)和回腸組織FXR、頂端Na~+-膽汁酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)、回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)、MRP2蛋白的mRNA表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)肝組織FXR、CYP7A1、UGT1A1、BSEP、MRP2、NTCP、OATP1A1和回腸組織FXR、IBABP、MRP2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)篩選確定了殘黃片組方單藥的最佳超微粉碎時(shí)間:黃連25 min、青黛10 min、白礬5 min、郁金25 min。工藝1最佳粉碎條件為4味藥按比例混合后超微粉碎20 min。黃連郁金粉碎復(fù)合最佳時(shí)間為25 min,青黛白礬粉碎復(fù)合最佳時(shí)間為10 min,即工藝2最佳粉碎條件為黃連郁金粉碎復(fù)合25 min,青黛白礬粉碎復(fù)合10 min,再將二者混勻。工藝3粉碎條件為黃連郁金粉碎復(fù)合25min,加入青黛粉碎復(fù)合10 min,最后加入白礬粉碎復(fù)合5 min。3種粉碎工藝制備的粉體特性各有差異,粉體電鏡掃描形態(tài)分析上工藝1粉體未見(jiàn)復(fù)合粒子結(jié)構(gòu),分散不均勻,粉體顆粒的大小差異較大。工藝2粉體偶見(jiàn)復(fù)合粒子結(jié)構(gòu),但分散不均勻,局部有分層。工藝3粉體全視野可見(jiàn)結(jié)構(gòu)規(guī)整的蜂窩狀復(fù)合粒子結(jié)構(gòu),粉體分散均勻。粉體熱穩(wěn)定性方面工藝1比熱容為262.1 J·g~(-1),工藝2比熱容為242.7 J·g~(-1),工藝3比熱容為295.9 J·g~(-1),熱穩(wěn)定性工藝3最佳。3種超微粉碎工藝對(duì)成型中間體的得率均有提升,高溫、高濕、強(qiáng)光影響因素下工藝2和工藝3片各項(xiàng)檢測(cè)合格,提升了殘黃片質(zhì)量穩(wěn)定性。(2)通過(guò)殘黃片成分的類(lèi)藥性篩選共得到了174個(gè)成分,其中黃連25個(gè),成分類(lèi)型主要有異喹啉類(lèi)生物堿、有機(jī)酸和木脂素類(lèi);青黛14個(gè),主要為吲哚類(lèi)生物堿;郁金135個(gè),主要由倍半萜類(lèi)和二苯基庚烴(姜黃素)類(lèi)成分組成。搜集得到治療黃疸相關(guān)靶點(diǎn)共32個(gè),分子對(duì)接篩選出作用靶點(diǎn)14個(gè),潛在活性成分共37個(gè)。成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)分析得出穆坪馬兜鈴酰胺、corchoroside A、槲皮素、去甲氧基姜黃素、小檗浸堿、榿木酮、黃柏酮、氫化小檗堿、姜黃素、柚皮素共10個(gè)成分與單胺氧化酶A、前列腺素合酶2、內(nèi)皮型一氧化氮合酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、細(xì)胞色素P450 2E1、GTP環(huán)化水解酶1、法尼醇X受體等7個(gè)以上靶點(diǎn)作用,對(duì)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性具有重要貢獻(xiàn),可能通過(guò)調(diào)節(jié)膽紅素代謝、調(diào)控膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制免疫與炎癥反應(yīng)、影響肝臟膠原形成等途徑發(fā)揮退黃作用。(3)退黃保肝作用比較結(jié)果顯示,模型組大鼠血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP含量顯著高于正常組(P0.01),表明黃疸模型復(fù)制成功。對(duì)比模型組,CHP組、原CHP組和UDCA組血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP水平均有顯著降低(P0.01或P0.05),表明殘黃片中劑量(0.315 g·kg~(-1)·d~(-1))的退黃作用明顯。而CHP高劑量組TBIL、TBA水平高于模型組,有加重黃疸的風(fēng)險(xiǎn)。工藝優(yōu)化殘黃片以0.315 g·kg~(-1)·d~(-1)的劑量干預(yù)對(duì)降低血清TBIL、TBA、ALT、AST、ALP水平的作用優(yōu)于UDCA(P0.01)和原CHP,提示殘黃片工藝優(yōu)化后促進(jìn)了退黃保肝作用,且中劑量作用優(yōu)于高劑量。HE染色結(jié)果顯示正常組大鼠肝組織以小葉間靜脈為中心,規(guī)整排列,肝細(xì)胞間緊密連接,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整,細(xì)胞核大而圓,未見(jiàn)壞死或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肝組織病變明顯,肝細(xì)胞排列疏松紊亂,多數(shù)肝細(xì)胞核萎縮且有空泡產(chǎn)生,細(xì)胞間緊密連接被破壞。CHP組肝臟病變不明顯,肝細(xì)胞排列規(guī)整,緊密連接破壞較小,多數(shù)細(xì)胞核大而圓,少見(jiàn)空泡樣變性。RT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與模型組比較CHP能激活大鼠肝組織FXR的mRNA和蛋白的表達(dá)升高,顯著降低膽汁酸合成限速酶CYP7A1的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯(P0.01),抑制膽汁酸合成;促進(jìn)PXR和UGT1A1的mRNA表達(dá),顯著提高膽紅素代謝酶UGT1A1的表達(dá)(P0.01),促進(jìn)肝內(nèi)膽紅素的親水解毒和易于轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟。殘黃片對(duì)肝內(nèi)膽汁成分的外排蛋白BSEP、MRP2的mRNA和蛋白的表達(dá)均有顯著提高作用(P0.01),促進(jìn)膽汁酸和膽紅素排出肝臟,緩解肝內(nèi)膽汁淤積;并能明顯抑制膽汁肝臟攝取相關(guān)OATP1A1的表達(dá)(P0.01),減輕肝內(nèi)膽汁淤積情況。與模型組比較CHP能提升肝臟NTCP的mRNA和蛋白的表達(dá)。在回腸,與模型組比較CHP和UDCA均能顯著提高FXR的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)(P0.01),明顯抑制ASBT mRNA的轉(zhuǎn)錄,并顯著提高M(jìn)RP2的mRNA和蛋白的表達(dá)(P0.01),抑制膽汁酸的腸吸收并促進(jìn)膽紅素等的腸道排出。與模型組比較CHP還能促進(jìn)IBABP的mRNA和蛋白的表達(dá)使其趨于正常水平。結(jié)論:(1)采用復(fù)合粒子制備方法優(yōu)化殘黃片粉碎工藝,使其粉體形成結(jié)構(gòu)規(guī)整、分散均勻、熱穩(wěn)定性好的復(fù)合粒子,解決了青黛白礬混合不均勻和裂片、碎片的問(wèn)題,并提高了制劑中間體得率,提升了殘黃片質(zhì)量穩(wěn)定性。(2)通過(guò)分子對(duì)接篩選出殘黃片退黃潛在活性成分37個(gè),作用靶點(diǎn)14個(gè),分析得出其退黃機(jī)制可能與調(diào)節(jié)膽紅素代謝、調(diào)控膽汁酸合成轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制免疫與炎癥反應(yīng)、影響肝臟膠原形成等作用有關(guān)。(3)殘黃片對(duì)膽汁的肝腸循環(huán)有調(diào)節(jié)作用,工藝優(yōu)化殘黃片以0.315 g·kg~(-1)·d~(-1)的中劑量干預(yù)黃疸模型大鼠,退黃保肝作用優(yōu)于其高劑量干預(yù)和原粉碎工藝殘黃片的治療作用,表明殘黃片制備工藝的優(yōu)化提升了其退黃保肝作用,且提示高劑量給藥有加重黃疸的風(fēng)險(xiǎn)。該品能提高黃疸模型大鼠肝臟FXR的表達(dá),顯著抑制CYP7A1的mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯,減少膽汁酸的合成,緩解膽汁淤積。殘黃片還能明顯抑制OATP1A1的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá),減少膽紅素和部分膽汁酸的肝臟攝取,緩解肝內(nèi)膽汁淤積。同時(shí),殘黃片還提高了肝臟BSEP和MRP2的表達(dá),促進(jìn)了肝內(nèi)膽汁酸、膽紅素的排出,降低了淤積的膽汁成分對(duì)肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的損傷。殘黃片通過(guò)激活肝臟FXR、PXR的基因轉(zhuǎn)錄和提高FXR的表達(dá),顯著提升了UGT1A1和MRP2的表達(dá),促進(jìn)了未結(jié)合膽紅素親水解毒和排出肝臟。在回腸殘黃片提高了FXR和MRP2的mRNA和蛋白的表達(dá),促進(jìn)膽汁成分的腸分泌排出。本研究解決了現(xiàn)有工藝中存在的青黛白礬混合不均勻和成品質(zhì)量不穩(wěn)定的問(wèn)題,提升了殘黃片質(zhì)量穩(wěn)定性,預(yù)測(cè)了其潛在活性成分和退黃作用靶點(diǎn),比較了工藝優(yōu)化前后殘黃片退黃保肝作用,并從調(diào)節(jié)膽汁肝腸循環(huán)角度驗(yàn)證了分子對(duì)接預(yù)測(cè)的退黃作用靶點(diǎn)和機(jī)制。
【圖文】：

殘黃片制備工藝優(yōu)化與退黃作用機(jī)制研究表 1-8 殘黃片不同超微粉碎工藝粉特性評(píng)價(jià)Table 1-8 Evaluation on characteristics ofCanhuang tablet ultrafine powder under different grinding processe工藝 粒徑/μm 比表面積/m2·kg-1振密度/g·mL-1松密度/g·mL-1振密度松密度D10D50D901 13.25 31.71 60.20 2284.77 0.64 0.46 1.392 12.33 41.28 136.30 2583.66 0.61 0.40 1.533 10.51 27.68 51.23 3134.72 0.61 0.41 1.48工藝 1

殘黃片制備工藝優(yōu)化與退黃作用機(jī)制研究4.3.2 電鏡掃描粉體形態(tài)分析工藝 1 粉體未見(jiàn)立體或蜂窩狀復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)，粉體分散不均勻，在 2000 倍視野下可見(jiàn)粉體顆粒的大小差異較大。工藝 2 粉體偶見(jiàn)蜂窩狀復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)，但其粉體顆粒的大小差異大，，粒子見(jiàn)有分層，分散不均勻。工藝 3 粉體全視野可見(jiàn)結(jié)構(gòu)規(guī)整的蜂窩狀復(fù)合粒子結(jié)構(gòu)，且顆粒較小的粒子依附在較大顆粒表面，粉體分散的很均勻。粉體電鏡掃描形態(tài)見(jiàn)圖 1-2。
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：TQ461;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2612548