【摘要】：目的:觀察三葉苷(TLB)對(duì)過(guò)氧化氫(H_2O_2)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,并探究其潛在機(jī)制。方法:通過(guò)H_2O_2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。將PC12細(xì)胞分為空白組(Control)、空白+TLB 60μM組、模型組(400μM H_2O_2)、模型+TLB 15μM組、模型+TLB 30μM組、模型+TLB60μM組、模型+NAC 20μM組、空白+AMPK抑制劑組(Compound C 10μM)、空白+TLB 60μM+AMPK抑制劑組、模型+AMPK抑制劑組、模型+TLB 60μM+AMPK抑制劑組、Nrf2轉(zhuǎn)染組(Nrf2 siRNA)、Nrf2轉(zhuǎn)染+TLB 60μM組、模型+Nrf2轉(zhuǎn)染組、模型+TLB 60μM+Nrf2轉(zhuǎn)染組、Nrf2轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組(scrambled Nrf2 siRNA)、Nrf2轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照+TLB 60μM,AMPK抑制劑Compound C(10μM)在H_2O_2和TLB處理前1 h加入。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力,LDH ELISA法檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)滲漏率、Hochest33324及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,DCFH-DA、Mito-SOX Red熒光染色、Rhodamine 123分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、線粒體內(nèi)ROS及線粒體膜電位(MMP),試劑盒檢測(cè)Caspase 3/7活性、NAD~+/NADH比例、線粒體酶活性及ATP合酶活性,RT-PCR檢測(cè)Sirt3 mRNA及mtDNA基因水平,Western blot檢測(cè)Cyto c、Sirt3、FoxO3a、SOD2、ac-SOD2、GPx-1、IDH2、UCP2蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果:模型組細(xì)胞活力較空白組明顯降低,LDH滲漏率顯著增加,細(xì)胞早期凋亡率明顯升高,細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS水平升高,MMP降低,線粒體中Bax/Bcl-2比率顯著降低而在胞漿中顯著增加。此外,Cyto c蛋白表達(dá)、Caspase-3/7活力和MDA含量明顯增加,而GPx、IDH2、SOD2、ATP活力及p-AMPK水平、ERRα、Sirt3、IDH2、FoxO3a、ac-SOD2、UCP2、GPx-1蛋白表達(dá)明顯下降。而TLB作用48 h后較模型組可明顯增加PC12細(xì)胞活力,顯著減少LDH漏出率及細(xì)胞早期凋亡率及細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)ROS含量,并恢復(fù)MMP。此外,TLB能明顯增加線粒體中Bax/Bcl-2比率并降低胞漿中的Bax/Bcl-2比率、Cyto c含量和MDA含量,同時(shí),升高GPx、IDH2、SOD2、ATP活力及p-AMPK水平、ERRα、Sirt3、IDH2、FoxO3a、ac-SOD2、UCP2、GP_X-1蛋白表達(dá)。值得注意的是,AMPK抑制劑或沉默Nrf2后可取消TLB的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論:TLB對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制與AMPK/Nrf2/Sirt3信號(hào)通路調(diào)控介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)過(guò)多的ROS清除、抗氧化物酶活力提高,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【圖文】：

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 呂純著降低（接近 50%）[33]，因此將該濃度和孵育時(shí)間用于以下實(shí)驗(yàn)。為了探討 TLB對(duì) H2O2誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞損傷的影響，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定 PC12 細(xì)胞分別用 15、30、60 μM TLB 或 20 μM NAC 預(yù)處理 1 h 并繼續(xù)與 H2O2共孵育 48 h，結(jié)果顯示，TLB 能夠在一定范圍內(nèi)濃度依賴性地顯著降低 H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率（細(xì)胞活力分別為 66%、76%和 93%）[F（6,14） =65.682，P< 0.001]（圖 1A）。同時(shí)，經(jīng)TLB 預(yù)處理，PC12 細(xì)胞可顯著降低 H2O2誘導(dǎo)的 LDH 滲漏（LDH 滲漏率分別為由34%降至 26%、20%及 14%）[F（6,14）=25.742，P<0.001]（圖 1B）。此外，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察可證實(shí)，經(jīng) H2O2處理的 PC12 細(xì)胞明顯皺縮并懸浮于培養(yǎng)液中，而經(jīng) TLB 或 NAC 預(yù)處理的細(xì)胞則接近正常的形態(tài)（圖 1C）。以上結(jié)果表明 TLB 可在 H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中抑制細(xì)胞死亡。

23圖 2 TLB 對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 PC12 細(xì)胞凋亡的影響。經(jīng)不同濃度的 TLB（15、30、60 μM）預(yù)處理后，，用 400 μM H2O2處理 PC12 細(xì)胞 48 h。（A）Hoechst 33342 染色檢測(cè) H2O2誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞凋亡染色（標(biāo)尺=50 μm）。（B）通過(guò) Annexin V-FITC/PI 雙染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。（C）早期凋亡細(xì)胞的定量。（D）Bax 和 Bcl-2 在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的表達(dá)及 Cyto c在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)的代表性條帶。（E）細(xì)胞質(zhì)中的 Bax/Bcl-2 量化圖。（F）線粒體中的 Bax/Bcl-2量化圖。（G）Cyto c 統(tǒng)計(jì)圖。（H）Caspase 3/7 活力。（x ± SD, n=3）**P<0.01vs 空白組；#P<0.05vs H2O2組；##P<0.01 vs H2O2組。Fig.2 Effect of TLB on H2O2-induced apoptosis in PC12 cells. After pre-treatment with different
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2611399