【摘要】：肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一種由諸多原因引起的以肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,彌散性肺泡炎癥及肺間質(zhì)纖維化為特點(diǎn)的疾病。隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展,PF發(fā)病人數(shù)逐年增加,但是由于缺乏有效的治療手段,患者的預(yù)后差,死亡率高,嚴(yán)重影響人類健康�，F(xiàn)有的作用于單一靶點(diǎn),單一細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物均不能有效地延長肺纖維化患者的生存時(shí)間和提高其生存質(zhì)量。吡非尼酮、尼達(dá)尼布等是目前臨床上治療PF的常用藥物,但其作用靶點(diǎn)單一,且存在不同程度的副作用而不宜長期使用。一些中草藥及其有效成分在治療肺纖維化中具有作用于多靶點(diǎn)、多通路及副作用小的特點(diǎn),因此成為研究的熱點(diǎn)。去氫木香烴內(nèi)酯(dehydrocostus lactone,DCL)是由我國菊科植物云木香的干燥根中分離出來的萜類化合物。有研究表明,DCL具有抗炎、抗氧化等藥理作用。我們?cè)谇捌谒幬锖Y選中發(fā)現(xiàn),DCL可減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺部的炎性損傷。本研究擬采用體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)性PF模型,對(duì)DCL進(jìn)行藥效研究與機(jī)制探討。目的:分別采用博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠PF模型及TGF-β_1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞PF模型,研究DCL抗PF作用及其分子作用機(jī)制,為DCL用于臨床治療PF提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法:1.DCL對(duì)BLM誘導(dǎo)小鼠PF模型作用昆明種健康雄性小鼠120只,隨機(jī)分為6組:對(duì)照組(Control)、博萊霉素組(bleomycin,BLM)、DCL低(DCLL)、中(DCLM)、高(DCLH)劑量組及吡非尼酮組(pirfenidone,PFD),每組20只。除Control組小鼠氣管內(nèi)滴入0.9%氯化鈉注射液外,其余各組動(dòng)物均經(jīng)氣管內(nèi)一次性滴入BLM溶液5 mg/kg,建立肺纖維化模型。第2天開始治療組動(dòng)物開始灌胃給藥,每天一次,連續(xù)21天。DCLL、DCLM及DCLH組的劑量分別為5、10及20 mg·kg~(-1)·d~(-1),PFD組的劑量為50mg·kg~(-1)·d~(-1),Control及BLM組均給予等容量的生理鹽水。在造模后第7、14及21天,記錄小鼠的體重及存活率,隨后處死動(dòng)物,取血及留取肺組織樣本,-80℃凍存?zhèn)溆�。采用HE及Masson染色觀測(cè)小鼠肺組織形態(tài)變化、炎癥程度以及膠原累積程度;免疫組織化學(xué)法和Western Blot法檢測(cè)小鼠肺組織中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA表達(dá);ELISA試劑盒檢測(cè)肺組織中羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。2.DCL對(duì)TGF-β_1誘導(dǎo)HELF細(xì)胞PF模型的作用正常培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblast,HELF)接種于6孔板中,調(diào)整細(xì)胞密度為1×10~5個(gè)/mL,每孔2 mL,培養(yǎng)24 h后棄上清。隨機(jī)分為6組:對(duì)照組(Control)、TGF-β_1組(Model)、DCLL、DCLM、DCLH及PFD組。各組均用2 mL無血清DMEM,除對(duì)照組外,其他組均加入10μg/L TGF-β_1,再培養(yǎng)24 h后棄上清。隨后,(1)Control組及(2)Model組加入2 mL無血清DMEM;(3)-(5)組,即DCLL、DCLM及DCLH組,分別加入2 mL含5、10或20μM DCL的無血清DMEM;(6)PFD組加入2 mL含10μM PFD的無血清DMEM。各組培養(yǎng)24 h后,于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;收集細(xì)胞全蛋白和核蛋白,Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞Collagen-Ⅲ、Collagen-Ⅰ和α-SMA表達(dá);細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)。3.DCL對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響在TGF-β_1誘導(dǎo)HELF細(xì)胞PF模型及BLM誘導(dǎo)小鼠PF模型上,分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCL對(duì)HELF細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影響;ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠肺組織中GSH含量,小鼠血清中MDA及SOD含量。4.DCL對(duì)TGF-β_1/Smad_2和NOX_4/Nrf_2通路的影響Western Blot法檢測(cè)TGF-β_1誘導(dǎo)HELF細(xì)胞PF模型及BLM誘導(dǎo)小鼠PF模型上TGF-β_1、Smad_2、p-Smad_2、NOX_4及Nrf_2表達(dá),并檢測(cè)細(xì)胞核蛋白中Nrf_2表達(dá)。5.預(yù)測(cè)潛在治療因子的驗(yàn)證正常培養(yǎng)的HELF細(xì)胞,接種于6孔板中,調(diào)整密度為1×10~5個(gè)/mL,每孔2 mL。培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)更換新鮮無抗生素、無血清的DMEM,準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)染。觀察Nrf_2 siRNA對(duì)細(xì)胞增殖率、纖維化程度及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路因子的影響,實(shí)驗(yàn)分為4組:Control、TGF-β_1組、TGF-β_1+陰性對(duì)照組及TGF-β_1+Nrf_2 siRNA組。觀察Nrf_2基因敲低后DCL對(duì)細(xì)胞增殖率、纖維化程度及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,實(shí)驗(yàn)分為5組:Control、TGF-β_1組、DCL+TGF-β_1組、TGF-β_1+DCL+陰性對(duì)照組及TGF-β_1+DCL+Nrf_2 siRNA組。轉(zhuǎn)染4-6 h后棄培養(yǎng)基,重新加入無抗生素、無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光判斷轉(zhuǎn)染率。除Control外,各組均加入10μg/L的TGF-β_1刺激24 h,成肺纖維化模型,再加入10μM的DCL,24h后收集細(xì)胞。Western Blot檢測(cè)Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.DCL減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化給予BLM后,小鼠的一般狀況較差,而不同劑量的DCL組小鼠的一般狀況良好。HE染色結(jié)果顯示,BLM組的肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,損傷分布廣泛。用藥各組隨著用藥時(shí)間延長肺組織結(jié)構(gòu)逐漸清晰、形態(tài)基本恢復(fù)正常,肺泡間隔增厚不明顯。Szapiel評(píng)分結(jié)果顯示,DCL各劑量組小鼠肺泡炎癥程度均明顯減輕(P0.05)。Masson染色結(jié)果表明,BLM組的肺組織出現(xiàn)大量膠原纖維,用藥各組的纖維化程度明顯減少(P0.05或P0.01)。與BLM組相比,用藥各劑量組小鼠肺組織中Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和α-SMA蛋白表達(dá)及HYP水平顯著性降低(P0.01)。給藥后21天,與DCLL組相比,DCLH組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表達(dá)(P0.05或P0.01)明顯減少;并且與PFD組相比,DCLH組上述三項(xiàng)指標(biāo)也有顯著降低(P0.05或P0.01);DCLH組HYP水平顯著低于DCLL組(P0.05)。2.DCL減輕TGF-β_1誘導(dǎo)HELF細(xì)胞纖維化。MTT結(jié)果顯示,濃度不高于20μM時(shí),DCL未見明顯的細(xì)胞毒性。與Model組比較,DCL各劑量組Collagen-Ⅰ和Collagen-Ⅲ均降低;細(xì)胞免疫熒光和Western Blot檢測(cè)α-SMA,結(jié)果顯示,正常組和用藥各劑量組HELF細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)均顯著降低(P0.05)。與DCLL組相比,DCLH組Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低(P0.05或P0.01)。3.DCL對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響檢測(cè)小鼠肺組織中GSH含量、血清中MDA、SOD含量及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示,與BLM組相比,DCLL、DCLM及DCLH組的MDA水平顯著性降低(P0.05),SOD水平均顯著性升高(P0.05),ROS水平顯著降低(P0.05),DCLM和DCLH組GSH水平顯著性升高(P0.05)。4.DCL對(duì)TGF-β_1/Smad_2和NOX_4/Nrf_2通路影響檢測(cè)小鼠肺組織及細(xì)胞內(nèi)TGF-β_1、Smad_2、NOX_4和Nrf_2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與BLM組相比,DCL各劑量組小鼠肺組織中TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白表達(dá)顯著性降低(P0.05),Nrf_2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05);結(jié)果顯示,與TGF-β_1模型組相比,DCL各劑量組HELF細(xì)胞中TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白顯著降低(P0.05),Nrf_2在核蛋白和全蛋白中表達(dá)顯著升高(P0.05),在胞漿中表達(dá)降低。5.預(yù)測(cè)治療PF潛在因子的驗(yàn)證結(jié)果顯示,與Control組相比,TGF-β_1組細(xì)胞的增殖率顯著升高(P0.05),Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)(P0.05);與TGF-β_1組相比,TGF-β_1+Nrf_2 siRNA組細(xì)胞的增殖率升高,Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)。用DCL干預(yù)后,與DCL+TGF-β_1組相比,TGF-β_1+DCL+Nrf_2 siRNA組細(xì)胞增殖率也有所升高;Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ及α-SMA蛋白表達(dá)均顯著升高(P0.05)。結(jié)論:1.DCL顯著減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠PF。2.DCL有效抑制TGF-β_1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞PF模型程度。3.在BLM誘導(dǎo)PF小鼠及TGF-β_1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞PF模型中,DCL下調(diào)MDA和ROS水平、上調(diào)GSH和SOD水平,影響氧化應(yīng)激水平。4.在BLM誘導(dǎo)PF小鼠模型和TGF-β_1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞PF模型中,DCL可以下調(diào)TGF-β_1、p-Smad_2、NOX_4蛋白表達(dá),上調(diào)Nrf_2表達(dá)水平。5.在HELF轉(zhuǎn)染敲低Nrf_2后,DCL干預(yù)不降低Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ和和α-SMA蛋白的表達(dá)。
【圖文】：

圖 1.3 不同劑量 DCL 對(duì)實(shí)驗(yàn)性 BLM 誘導(dǎo) PF 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色，，×100）圖 1.4 不同劑量 DCL 對(duì)實(shí)驗(yàn)性 BLM 誘導(dǎo) PF 小鼠肺組織炎癥評(píng)分的影響(n=6, X±SD)***P<0.001 vs Control;#P<0.05,##P<0.01 vs BLM

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文見大量藍(lán)色膠原纖維增生維(P<0.05)。使用 DCL 和 PFD 以后，膠原纖維減少 PFD組、DCL各組與BLM組比較在第7天肺纖維化面積并沒有出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，在第 2 周和第 3 周天小鼠肺纖維化程度同時(shí)都比模型組明顯降低(P<0.05)。結(jié)果表明 DCL 可以減少博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化的小鼠肺組織膠原纖維生成，抑制膠原沉積。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2610848