【摘要】：目的:本研究以基于補(bǔ)腎和脈理論的組方“補(bǔ)腎和脈方”對高齡自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)進(jìn)行干預(yù),評估補(bǔ)腎和脈顆粒的降壓及腎臟靶器官保護(hù)作用;并通過觀察其對高齡SHR腎臟血管緊張素II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor,AT1)及其下游 3-磷酯酰肌醇激酶,(phosphatidylinositol 3-ki-nase,PI3K)/AKT、RhoA/ROCK通路的影響,從分子水平探討明確補(bǔ)腎和脈顆�？赡艿哪I臟作用靶點(diǎn)及其降壓的藥理機(jī)制;并試圖應(yīng)用腎動脈超聲多普勒技術(shù)評估高齡SHR腎動脈血流參數(shù)(主要包括:阻力指數(shù)RI、搏動指數(shù)PI、血流速度),觀測干預(yù)前后各項腎動脈血流動力學(xué)指標(biāo)變化,分析其相關(guān)意義,以期為“老年高血壓病從腎、從絡(luò)論治”提供“宏觀”的血流動力學(xué)數(shù)據(jù)支持;進(jìn)一步通過觀察其對高齡SHR腎臟α-平滑肌肌動蛋白(Smooth muscle actin-α,α-SMA)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白 3(drosophila mothers against decapentaplegic 3,SMAD3)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1(Fibroblast-specific protein-1,FSP-1)的表達(dá)改變,評估大鼠腎小球硬化、腎臟纖維化程度,從分子水平探討補(bǔ)腎和脈顆粒實現(xiàn)靶器官保護(hù)、逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的作用機(jī)制。方法:1.16月齡雄性SHR大鼠30只,隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對照組、西藥對照組、補(bǔ)腎和絡(luò)顆粒組(n=10),以16月齡雄性WKYKyoto大鼠10只和8周齡雄性WKY大鼠10只作為空白對照組。分別給藥:補(bǔ)腎和脈顆粒組(補(bǔ)腎和脈顆粒生藥濃度生藥濃度14.22g.kg-1.d-1)、西藥對照組給纈沙坦(14.4mg.kg-1.d-1),模型組和空白對照組給予等量生理鹽水灌胃、灌胃體積均為2mL,每天灌胃一次,共計8周。2.補(bǔ)腎和脈顆粒降壓及保護(hù)腎臟療效研究:(1)尾動脈加壓法每周測量大鼠血壓。(2)MindrayM5彩色多普勒超聲診斷儀直接接觸法掃查測量腎動脈血流參數(shù)最大速度(Vp)、最小速度(Vd)、平均流速(Vm)以及阻力指數(shù)(RI)、搏動指數(shù)(PI)。(3)酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)8周結(jié)束后檢測尿中視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CystainC)8周結(jié)束后,處死大鼠,下腔靜脈取血,分離血清,常規(guī)化學(xué)法檢測血清肌酐、尿素氮,酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)檢測血清血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、血管加壓素(Arginine Vasopressin,AVP)、內(nèi)皮素(Endothelin,ET)等血清學(xué)指標(biāo)改變。(4)分離大鼠腎臟,HE染色及透射電鏡觀察腎臟及主腎動脈大體病理改變和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化,免疫組織化學(xué)法(IHC)觀察腎臟組織中AT1受體、TGF-β受體的分布改變,觀察腎臟中血壓相關(guān)的受體和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)與分布情況。3.分子水平探討明確補(bǔ)腎和脈顆粒可能的腎臟作用靶點(diǎn)及補(bǔ)腎降壓的藥理機(jī)制研究:(1)提取腎臟mRNA和總蛋白,實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)法分別檢測AT1及其下游PI3K、AKT、RhoA、ROCK的mRNA表達(dá)改變,Western Blotting法檢測了 AKT的蛋白表達(dá),明確該方的降壓機(jī)制。4.分子水平探討明確補(bǔ)腎和脈顆粒實現(xiàn)靶器官保護(hù)、減輕腎臟纖維化的作用機(jī)制研究:分離大鼠腎臟,馬松染色觀察腎臟及腎動脈(包括主腎動脈、段動脈)膠原沉積情況和纖維化程度。提取腎臟mRNA和總蛋白,實時熒光定量PCR(Q-PCR)法分別檢測 α-SMA、CTGF、TGF-β1、SMAD3、FSP-1,Western Blotting 法檢測 CTGF、FSP-1、TGF-β的蛋白表達(dá),明確該方減緩腎臟纖維化的作用機(jī)制。結(jié)果:1.SHR大鼠體重顯著低于WKY對照組大鼠(P0.05),其毛色略發(fā)黃,精神亢奮,睡眠差;用藥后,大鼠一般狀況有不同程度的改善,且補(bǔ)腎和脈顆粒組大鼠平均體重略有增加。2.補(bǔ)腎和脈顆粒降壓及保護(hù)腎臟療效:(1)治療8周后,補(bǔ)腎和脈顆粒及纈沙坦組收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均明顯降低(P0.05)。補(bǔ)腎和脈顆粒組壓差明顯下降,小于纈沙坦組,而舒張壓及平均動脈壓高于纈沙坦組。(2)腎臟多普勒超聲顯示補(bǔ)腎和脈顆粒與西藥纈沙坦組腎動脈最大血流速度、最小血流速度增加,RI、PI值均明顯低于模型組(P0.05)。(3)給藥8周后,Elisa法檢測顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組及西藥纈沙坦組尿中RBP、β2-MG、CystainC水平明顯低于模型組(P0.05)。(4)常規(guī)化學(xué)法檢測顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組及西藥纈沙坦組血中血清肌酐、尿素氮水平明顯低于模型組(P0.05)。(5)Elisa法檢測顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組及西藥纈沙坦組血中AngⅡ、AVP、ET水平明顯低于模型組(P0.05)。(6)HE染色可見補(bǔ)腎和脈顆粒組及西藥纈沙坦組腎小球體積大小適中,系膜區(qū)增生較少,系膜基質(zhì)、膠原纖維增生較少,毛細(xì)血管擴(kuò)張程度較輕,腎間質(zhì)纖維細(xì)胞輕度增生,伴有少量炎細(xì)胞浸潤,透射電鏡示補(bǔ)腎和脈顆粒組及纈沙坦組足突融合明顯改善,系膜細(xì)胞及間質(zhì)增生明顯減輕,細(xì)胞器豐富,線粒體腫脹,可見自噬小體,基底膜結(jié)構(gòu)正常;腎動脈血管細(xì)胞排列有序,管壁光滑,中膜平滑肌增厚重塑現(xiàn)象有所減輕。(7)馬松染色示:補(bǔ)腎和脈顆粒組及纈沙坦組腎小管、腎間質(zhì)有少量纖維化沉積,腎小管輕度擴(kuò)張,腎小囊腔輕度擴(kuò)張,腎小球輕度纖維增生。(8)免疫組織化學(xué)法顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組及西藥纈沙坦組AT1、TGF-β受體表達(dá)明顯低于模型組(P0.05)。提示補(bǔ)腎和脈顆粒可有效控制血壓、保護(hù)腎臟。3.補(bǔ)腎和脈顆�？赡艿哪I臟作用靶點(diǎn)及補(bǔ)腎降壓的藥理機(jī)制研究:熒光定量PCR(Q-PCR)顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組 PI3K、AKT、RhoA、Rock、α-SMA、CTGF、TGF-β、SMAD3、FSP-1 的 mRNA 表達(dá)水平明顯低于模型組(P0.05)。Western Blotting法顯示補(bǔ)腎和脈顆粒組AKT、CTGF、TGF-β、FSP-1蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組(P0.05)。結(jié)論:補(bǔ)腎和脈顆�？捎行Э刂蒲獕�,改善腎臟血流動力學(xué)指標(biāo),改善SHR腎損害的程度。補(bǔ)腎和脈顆粒通過阻斷AT1、TGF-β及PI3K/AKT、RhoA/ROCK通路表達(dá)來調(diào)節(jié)血壓,并通過抑制TGF-β/CTGF通路的活化實現(xiàn)靶器官保護(hù)及減緩腎臟纖維化。
【圖文】：

邐補(bǔ)賢和脈顆粒干預(yù)高齡ＳＨＲ腎損害的作用機(jī)制研究邐逡逑表３各組大鼠舒張壓比較（Ｘ邋士邋ｓ）逡逑組別邐ｎ邐Ｏｗ邐２ｗ邐４ｗ邐６ｗ邐８ｗ逡逑纈沙坦組邐１０邐１３４．２８±６．７４邐１２４．２３±５．３８Ａ邐１１６．２３±５＿４３Ａ邐１１０．９６±５．５３Ａ邐１０２．３３±４．９３Ａ逡逑補(bǔ)腎和脈組邐ｌ0邐１３５．２８±９．６６邐１２６．９１±９．３１邐１２２．６２±８．７３ａ邐１１９．５６±９．９５ａ邐１１４．０４±８．５７ａ逡逑模型組邐１０邐１３６．７４±４．２４＊邐Ｉ３７．１８±５．４６＊邐１３６．４６±４．１６＊邐１３５．７３±６．５６＊邐１３３．８７±５．２７＊逡逑，0邋９２，５±３－５６邐９１７４±３．８４邐％邋施３邋２７邐９Ｕ５±３．２６邐９0．９２土３６３逡逑：且周齡邋ＷＫＹ邐丨邋0邐們遍分邐８６邋３７±８邋３４邐８}0邋６３邐＿土６Ｊ２邐８６，６±８．６７逡逑注：＊與丨６月齡ＷＫＹ組比較，Ｐ＜０．０５；么與５？１１１模型組比較，Ｐ＜０．０５。逡逑

圖３各組大鼠平均動脈壓比較逡逑注：＊與１６月齡ＷＫＹ組比較，，Ｐ＜０．０５；邋△與ＳＨＲ模型組比較，ＰＣ０．０５。逡逑表５各組大鼠脈壓比較（ｘ邋±ｓ）逡逑組別邐ｎ邐Ｏｗ邐２ｗ邐４ｗ邐６ｗ邐８ｗ逡逑纈沙坦組邐１０邐５７．２５士３．０５邐４９．２５士２．５８邐５４．４５±２．７４Ａ邐５３．８９士邋２．６８邋Ａ邐５４．２３士邋２．７６Ａ逡逑補(bǔ)腎和脈組邐１０邐５９．１３邋士邋３．１６邐５５．３６邋士邋２．８０邐５１．７６邋土邋２．６２Ａ邐４８．９８土邋２．３９Ａ邐４８．８９土邋２．３７Ａ逡逑模型組邐１０邐５５．９８士邋２．８２’邐５４．８９土２．７６＊邐５６．４５邋土邋２．８９＊邐５７．５９土３．１５＊邐５９．８９士邋３．２７＊逡逑１邋／－邋ＦＩ邐Ｖ逡逑組，邐，０邐３３．２３±１．７８邐３３．７８±１．９０邐３５．２３±２．？邐３５．}0邋３邐３４．胸５逡逑８邋周齡邋ＷＫＹ邋組邋１０邐２５．１２±１．５６邐２９．８９±１．６４邐２７．２３±１．６２邐３１．２３±１．８８邐２８．２３±１．７３逡逑注：＊與１６月齡ＷＫＹ組比較，ＰＣ０．０５；邋△與５１４１１模型組比較，ＰＣ０．０５。逡逑７０逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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