【摘要】：背景腦水腫動(dòng)物模型是研究臨床上各種病因?qū)е履X水腫的重要載體,目前感染性腦水腫動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)多采用脂多糖注射制備,檢測腦含水量,但需處死動(dòng)物,或僅檢測體溫、自主活動(dòng),其針對(duì)性和可靠性較差,缺乏評(píng)價(jià)體系�；铙w成像作為一種無創(chuàng)的形態(tài)定量的先進(jìn)檢測手段,尚未被應(yīng)用到腦水腫動(dòng)物模型的研究上。著名清涼開竅中藥冰片具有抗炎、抗腦水腫等現(xiàn)代藥理作用。近年發(fā)現(xiàn),腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的網(wǎng)格蛋白與小窩蛋白均參與了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接蛋白的降解,進(jìn)而增強(qiáng)了血腦屏障通透性,導(dǎo)致腦水腫發(fā)生。這一作用被稱為腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用。但冰片是否能調(diào)節(jié)內(nèi)吞作用,是否通過內(nèi)吞作用而保護(hù)血腦屏障,目前尚未見報(bào)道。目的基于活體成像建立脂多糖致腦水腫大鼠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)體系;觀察冰片對(duì)脂多糖致腦水腫的改善作用機(jī)制,是否與保護(hù)血腦屏障和抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用有關(guān)。方法1.考察并改良脂多糖致腦水腫大鼠模型的建模方法取雄性SD大鼠,通過考察脂多糖注射劑量(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)、注射方式(尾靜脈注射、腹腔注射)、造模時(shí)間(6 h、12 h、24 h、36 h)、注射次數(shù)(單次、兩次、三次)等造模條件,以腦含水量為檢測指標(biāo),對(duì)脂多糖致大鼠腦水腫模型進(jìn)行優(yōu)化改良。2.建立基于活體成像的腦水腫大鼠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)體系的方法觀察以下指標(biāo),篩選造模成功與否的判定指標(biāo)依據(jù):采用24小時(shí)錄像方法記錄動(dòng)物是否有:(1)體毛聳直,精神萎靡;(2)弓背埋頭的動(dòng)作體征;在18 h內(nèi)觀察是否有:(3)腹瀉;(4)眼部、口鼻部出血;(5)在0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時(shí)采用大鼠體溫計(jì)檢測體溫,繪制體溫變化曲線;(6)在18 h采用FX7型活體成像儀檢測頭部平均熒光強(qiáng)度。2.冰片對(duì)腦水腫的改善作用試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥造模18 h后,將造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組:模型組、安宮牛黃丸組、冰片100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400mg·kg-1組,每組10只,另取正常對(duì)照組大鼠10只。造模24 h后,分別灌胃給予相應(yīng)藥物,對(duì)照組和模型組灌胃等體積的溶劑0.5%羧甲基纖維素鈉,灌胃1 h后取材。3.冰片對(duì)腦水腫的作用觀察指標(biāo)及其測定方法灌胃給藥30 min后,尾靜脈注射2.3 mg·kg-1吲哚菁綠,活體成像觀察腦部熒光,計(jì)算平均熒光量。灌胃給藥1 h后,將動(dòng)物分為4批分別取材檢測:(1)心臟灌流多聚甲醛,取腦,石蠟切片,HE染色,觀察其組織形態(tài)。(2)心臟灌流2.5%戊二醛,取腦,制備為電鏡切片,觀察腦微血管周圍水腫程度。(3)心臟灌流生理鹽水,再灌流4%伊文思藍(lán)(mg/ml)75 ml后灌流生理鹽水沖洗,取腦,分左右兩半,稱濕重:左腦冷凍干燥12 h后稱干重,干濕重法計(jì)算腦含水量;右腦切碎,按每100 mg腦組織加350μl甲酰胺,56℃浸提12 h,取上清液檢測吸光度。(4)取腦組織,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)表達(dá),免疫印跡法測水通道蛋白4(AQP4)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS)表達(dá),硝酸還原酶法測定腦一氧化氮(NO)含量。4.冰片對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用觀察指標(biāo)及其測定方法(1)取上述電鏡切片,透射電鏡觀察腦內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞器、緊密連接完整性。(2)取腦組織,以免疫印跡法測定緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá)。5.冰片對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)觀察指標(biāo)及其測定方法(1)取上述電鏡切片,透射電鏡觀察腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞囊泡的數(shù)量、體積。(2)取腦組織,以免疫印跡法測定內(nèi)吞蛋白caveolin 1、CHC、自噬相關(guān)蛋白LC3、becline 1、p-Akt、Akt、p-ERK 1/2、ERK 1/2的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定p-MEK 1/2、MEK 1/2、MMP-2、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果1.脂多糖致腦水腫大鼠模型改良成功與正常大鼠對(duì)照組相比,采用雄性大鼠于0、12 h分兩次腹腔注射脂多糖各5 mg·kg-1造模24 h,腦含水量顯著升高(P0.05),表明造模成功。2.基于活體成像的腦水腫大鼠模型評(píng)價(jià)指標(biāo)體系構(gòu)建成功經(jīng)過試驗(yàn)篩選后確定,同時(shí)滿足下列(1)、(2)、(3)項(xiàng)且滿足(4)、(5)、(6)其中任意一項(xiàng),視為造模成功:(1)體毛聳直,精神萎靡;(2)腹瀉;(3)活體成像頭部平均熒光強(qiáng)度不低于3800;(4)造模后0.5 h體溫高于造模前,3 h體溫低于造模前;(5)眼部、口鼻部可見出血;(6)有弓背埋頭的動(dòng)作體征。3.冰片能顯著改善脂多糖致大鼠的腦水腫程度(1)腦活體成像熒光強(qiáng)度:與模型組相比,冰片200 mg·kg-1、400 mg·kg-1組大鼠給藥后減給藥前腦部平均熒光強(qiáng)度差值顯著降低(均P0.05)。(2)腦含水量:與模型相相比,冰片400 mg·kg-1組腦含水量顯著降低(P0.05)。(3)腦組織形態(tài)改變:與模型組相比,冰片組腦水腫程度均有不同程度的改善。(4)血腦屏障通透性:與模型相相比,冰片組腦組織中伊文思藍(lán)含量顯著或極顯著降低(P0.05,P0.01)。(5)腦水腫的標(biāo)志性分子指標(biāo):與模型相相比,冰片組腦組織中TNF-α、IL-6、AQP4、i NOS、NO含量顯著或極顯著降低(P0.05,P0.01)。4.冰片能顯著保護(hù)脂多糖致腦水腫大鼠血腦屏障(1)血腦屏障形態(tài)學(xué):與模型組相比,冰片組內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接開放程度、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足水腫程度減輕。(2)緊密連接蛋白:與模型組相比,冰片組腦組織中claudin-5、occludin、ZO-1含量顯著升高(P0.05)。5.冰片能顯著抑制脂多糖致腦水腫大鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞作用(1)內(nèi)吞囊泡的形態(tài)觀察:與模型組相比,冰片組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞囊泡的形成數(shù)量減少。(2)內(nèi)吞蛋白:與模型組相比,冰片組腦組織中caveolin 1含量極顯著降低(P0.01),冰片400 mg·kg-1組腦組織中CHC含量顯著升高(P0.05)。(3)自噬相關(guān)蛋白:與模型組相比,冰片組腦組織中LC3、becline 1含量顯著降低(P0.05)。(4)caveolin1—Akt/MEK/ERK—MMP-9通路:與模型組相比,冰片組腦組織中p-Akt/Akt、p-ERK/ERK、p-MEK/MER、MMP-2、MMP-9含量顯著或極顯著降低(P0.05,P0.01)結(jié)論1.改良的脂多糖建模方法模型成功。通過考察脂多糖注射劑量、注射方式、造模時(shí)間、注射次數(shù)等造模條件,對(duì)脂多糖致腦水腫模型進(jìn)行了優(yōu)化改良。改良后的造模方法為:雄性SD大鼠,0、12 h各腹腔注射5 mg·kg-1脂多糖24 h后,能成功構(gòu)建腦水腫模型。該模型不僅腦含水量、血腦屏障通透性以及常規(guī)的腦水腫分子指標(biāo)顯著升高,且活體成像腦部平均熒光強(qiáng)度極顯著升高,緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1含量顯著降低,內(nèi)吞蛋白caveolin-1、CHC、自噬相關(guān)蛋白LC3、becline 1含量顯著升高,模型穩(wěn)定。2.建立了基于活體成像的腦水腫大鼠模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)體毛聳直,精神萎靡;(2)腹瀉;(3)活體成像頭部平均熒光強(qiáng)度不低于3800;(4)造模0.5 h體溫高于造模前,3 h體溫低于造模前;(5)眼部、口鼻部可見出血;(6)有弓背埋頭的動(dòng)作體征。需同時(shí)滿足(1)、(2)、(3),且滿足(4)、(5)、(6)其中任意一項(xiàng),視為造模成功。3.冰片可顯著改善模型大鼠的腦水腫程度。冰片可減輕光鏡下、透射電鏡下腦水腫程度,顯著降低腦含水量、水通道蛋白AQP4的表達(dá),極顯著降低TNF-α、IL-6、i NOS的表達(dá),極顯著降低腦組織中NO的含量。4.冰片可能通過抑制內(nèi)吞作用及其下游通路抗腦水腫。冰片可保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu),上調(diào)緊密連接蛋白claudin-5、occludin、ZO-1的表達(dá),其機(jī)制可能與抑制內(nèi)吞作用、下調(diào)內(nèi)吞蛋白、抑制caveolin 1—Akt/MEK/ERK—MMP-9通路,從而逆轉(zhuǎn)病理?xiàng)l件下緊密連接蛋白降解有關(guān)。
【圖文】：
圖 1-1 血管源性水腫特征示意圖Figure 1-1 The schematic of vasogenic edema而炎癥反應(yīng)引起血腦屏障破壞的現(xiàn)象早已被人們發(fā)現(xiàn)。早在 1937 年，發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)可破壞血腦屏障[21]。而在 1956 年，Eckman[22]發(fā)現(xiàn)革蘭氏內(nèi)毒素脂多糖能破壞血腦屏障；Allen[23]于 1965 年同樣證明了此發(fā)現(xiàn)
圖 1-2 不同劑量對(duì)腦含水量的影響Figure 1-2 The effect of dosage on brain water content與對(duì)照組相比，，*P＜0.05。n=10， ±SD。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5;R-332
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本文編號(hào)：
2608956
