【摘要】：目的本課題以麻黃、桂枝為研究對象,通過研究麻黃、桂枝以及兩藥配伍對KM小鼠行為學改變,大腦組織形態(tài)學改變,腦組織神經(jīng)遞質、氧化應激因子、NLRP3炎癥因子蛋白的變化來探討桂枝拮抗麻黃中樞毒性作用的研究。本課題從藥效學角度觀察了桂枝對麻黃所致小鼠中樞興奮性毒性的抑制作用,同時也探究了桂枝拮抗麻黃中樞多巴胺神經(jīng)元毒性的作用機制。方法40只KM小鼠按體重隨機分為生理鹽水組、麻黃組(10g/kg)、麻黃-桂枝3:2組(10g/kg+6.67g/kg)、麻黃-桂枝3:1組(10g/kg+3.33g/kg)、桂枝組(6.67g/kg),每組8只,各組小鼠每天灌胃(ig)給藥1次,每次給藥容積為0.2ml/10g,連續(xù)14天。于第7天進行曠場實驗,第12、13天進行避暗實驗,各組小鼠末次給藥1h后脫頸椎處死取大腦,在冷凍的磷酸鹽緩沖液(PBS)中漂洗,迅速將大腦切分為左右兩半,取小鼠左半腦用相同方法切分成兩份,分別用錫箔紙包好存放于液氮中,小鼠右半腦固定在4%多聚甲醛中,備用。1.行為學檢測:實驗給藥第7天晚上進行曠場實驗,將小鼠放入曠場反應箱適應5s后觀察并記錄小鼠5min內(nèi)靜止時間、運動時間以及運動路程。實驗給藥第12天晚上進行第一次避暗實驗,將小鼠放入避暗箱適應5s后,按照流程開始實驗。24h后重復實驗觀察并記錄小鼠5min內(nèi)第一次進入暗室被電擊的時間(即潛伏期)以及總共電擊次數(shù)(即錯誤次數(shù));2.HE染色觀察小鼠腦組織結構損傷:將4%多聚甲醛固定液中小鼠腦組織海馬、皮層與紋狀體部位分離,常規(guī)石蠟包埋,4μm切片,HE染色,顯微鏡下觀察小鼠腦組織海馬、皮層與紋狀體病理損傷變化;3.多巴胺神經(jīng)遞質水平變化:采用免疫組化法檢測小鼠大腦海馬、紋狀體、皮層中多巴胺(DA)、多巴胺轉運體(DAT)含量;4.氧化應激水平檢測:采用化學法按照試劑盒說明書測定腦組織中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)含量;5.NLRP3炎癥小體檢測:采用免疫印跡法(Western blot)測定腦組織Nod樣受體蛋白3(NLRP3)、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)蛋白表達。結果1.麻黃桂枝配伍對KM小鼠曠場實驗、避暗實驗的影響曠場實驗:與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠自主活動明顯增加,表現(xiàn)為靜止時間降低,運動的時間增加,平均運動距離增加,均具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組自主活動明顯降低,表現(xiàn)為小鼠靜止時間增加,運動時間降低,平均運動降低,且具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01),麻黃-桂枝3:1組小鼠自主活動降低,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。避暗實驗:與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠潛伏期明顯縮短(P0.01),錯誤次數(shù)明顯增加(P0.01),且具有顯著的統(tǒng)計學意義,桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組潛伏期延長(P0.01),錯誤次數(shù)降低(P0.01),具有顯著的統(tǒng)計學意義。麻黃-桂枝3:1組小鼠潛伏期延長(P0.05),錯誤次數(shù)降低(P0.05),具有統(tǒng)計學意義。2.麻黃桂枝配伍對KM小鼠海馬、紋狀體、皮層多巴胺神經(jīng)遞質表達的影響與生理鹽水組相比,麻黃組小鼠大腦海馬、紋狀體、皮層DA、DAT表達明顯減少,平均光密度值顯著降低,且具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01),桂枝組DA、DAT表達差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2組、3:1組不同部位DA、DAT表達顯著升高,且具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01),其中3:2組升高更為明顯。3.麻黃桂枝配伍對KM小鼠海馬、紋狀體、皮層病理形態(tài)學的影響光鏡下生理鹽水組海馬區(qū)錐體細胞排列整齊,錐體細胞的數(shù)量和厚度未見異常,無神經(jīng)細胞壞死和小膠質細胞增生等現(xiàn)象,紋狀體結構正常,細胞間隙未見增寬,膠質細胞未見增生,皮層結構正常,被膜完整,皮質層神經(jīng)元的細胞結構清晰、排列整齊;與生理鹽水組相比,桂枝組海馬區(qū)、紋狀體、皮層結構基本正常,無明顯差異;麻黃組可見腦海馬區(qū)的CA1區(qū)有較多的錐體細胞壞死,小膠質細胞增生,紋狀體區(qū)域可見細胞間中度水腫,組織間隙增寬,膠質細胞明顯增生,皮質層神經(jīng)元細胞排列紊亂,細胞分層模糊,神經(jīng)元細胞散在分布,可見有神經(jīng)元細胞壞死,被小膠質細胞吞噬的衛(wèi)星現(xiàn)象;與麻黃組相比,麻黃-桂枝3:2、3:1組海馬、紋狀體、皮層病變均有不同情況改善。4.麻黃桂枝配伍對KM小鼠腦組織SOD、MDA、NO、NOS含量的影響與生理鹽水組比較,麻黃組腦組織中SOD活力顯著降低(P0.01),MDA、NO、TNOS、i NOS含量顯著升高(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與麻黃組比較,麻黃-桂枝3:2組,3:1組SOD活力明顯升高(P0.05),MDA、NO、TNOS、i NOS含量明顯降低,且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.麻黃桂枝配伍對KM小鼠腦組織NLRP3炎癥小體表達的影響與生理鹽水組比較,麻黃組腦組織中NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達顯著升高,且具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01),桂枝組與生理鹽水組差異不明顯,無統(tǒng)計學意義(P0.05);與麻黃組比較、麻黃-桂枝3:2組NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達顯著下降,且具有統(tǒng)計學意義(P0.05),麻黃-桂枝3:1組NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白表達均有不同程度降低,且Caspase-1蛋白表達符合統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論1.桂枝與麻黃配伍后能夠抑制麻黃對小鼠的中樞興奮性毒性作用,減少小鼠自主活動,減少小鼠學習記憶功能的錯誤,改善小鼠腦組織海馬、紋狀體、皮層病理損傷情況,麻黃與桂枝之間存在“相畏相殺”的配伍關系。2.桂枝可能通過升高多巴胺神經(jīng)遞質DA、DAT含量,增加抗氧化活性,減少氧化應激損傷,抑制NLRP3炎癥小體上調(diào)從而拮抗麻黃中樞多巴胺神經(jīng)毒性,且具有一定量效關系,隨著桂枝比例的增加,桂枝拮抗麻黃中樞毒性更為顯著。
【圖文】：

引起的 Ca2+內(nèi)流增加而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[37]。課題組前期采取高效液相色譜-熒光檢測法對小鼠大腦皮層氨基酸含量進行測定結果同時表明桂枝配伍麻黃后能升高小鼠腦內(nèi) IAA 神經(jīng)遞質 GABA、纈氨酸 (Valine, Val)、丙氨酸 (Alanine, Ala)、酪氨酸 (Tyrosine, Tyr) 含量水平，降低麻黃對氨基酸遞質水平含量的不利影響，維持了氨基酸類神經(jīng)遞質的穩(wěn)態(tài)，反映了桂枝殺麻黃，麻黃畏桂枝的配伍關系[24]。5. 研究思路為了進一步探索麻黃中樞神經(jīng)毒性，本實驗以中樞多巴胺神經(jīng)元損傷為切入點，利用行為學實驗分析系統(tǒng)、HE 染色、免疫組化、Western blot 等實驗技術，以麻黃、桂枝、麻黃-桂枝藥對作為研究對象，，深入研究了麻黃、桂枝以及麻黃-桂枝藥對對小鼠大腦中樞多巴胺能神經(jīng)元的作用以及 NLRP3 炎癥小體表達的影響，擴展了麻黃桂枝“相畏相殺”的中樞神經(jīng)毒性作用機制研究，為提高麻黃臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。具體的技術路線圖見圖 1。

3 實驗結果3.1 麻黃桂枝配伍對 KM 小鼠行為學結果的影響3.1.1 麻黃桂枝配伍對 KM 小鼠曠場實驗結果的影響表 1-3. 麻黃桂枝配伍對 KM 小鼠曠場實驗結果的影響( x s, n＝8)組別 N(只) 劑量(g/kg) 靜止 T(s) 運動 T(s) 運動 D(cm)生理鹽水組 8 - 158.29±33.74 141.78±33.74 1888.69±664.54麻黃組 8 10 108.43±14.83##191.64±14.84##3947.89±1146.19##麻黃-桂枝 3:2 組 8 10+6.67 139.17±14.31**160.89±14.31**2569.41±621.59*麻黃-桂枝 3:1 組 8 10+3.33 126.50±10.00*173.57±10.00*2882.18±420.61*桂枝組 8 6.67 148.55±14.88**151.54±14.88**1812.43±413.81**注：與生理鹽水組比較##P<0.01；與麻黃組比較**P<0.01，*P<0.05
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2608915