【摘要】：香菇(Lentinus edodes)是著名的藥食兩用菌,既味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,又具有多種藥理活性。香菇多糖(Lentinan)是從香菇子實(shí)體中提取得到的最有效生物活性成分,作為一種典型的β-(1-3)-D-葡聚糖,它具有降血糖、降膽固醇、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性。早在1980年代香菇多糖既作為抗癌藥物上市,在臨床上作為免疫增強(qiáng)劑用于癌癥的輔助治療。然而,其抗腫瘤作用的分子機(jī)制尚不明確,在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為香菇多糖僅能通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮間接抗腫瘤作用,而不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞;且主要表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)依賴。然而,本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),香菇多糖能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖,即發(fā)揮了非免疫途徑的抗腫瘤作用。因此,本論文旨在探究香菇多糖是否具有非免疫途徑的直接抗腫瘤作用及其內(nèi)在分子機(jī)制,為拓寬香菇多糖的臨床應(yīng)用、充分發(fā)揮其藥用價(jià)值及開發(fā)腫瘤治療新制劑提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本論文以房縣小香菇子實(shí)體為原料,沿用課題組已建立的工藝,提取、分離、純化得到精制香菇多糖(SLNT)并通過一系列手段進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。通過體外實(shí)驗(yàn)探究了香菇多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的非免疫途徑抗腫瘤作用;并建立T細(xì)胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型及T、B、NK細(xì)胞缺陷且巨噬細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng)等受損的HT-29荷瘤聯(lián)合免疫缺陷NOD/SCID小鼠模型,探討香菇多糖能否在不同程度免疫系統(tǒng)缺陷的小鼠體內(nèi)發(fā)揮其非免疫途徑的直接抗腫瘤活性;并著重從Ⅰ型程序性死亡(細(xì)胞凋亡)及Ⅱ型程序性死亡(自噬性細(xì)胞死亡)兩個(gè)角度探索了其可能的分子機(jī)制。本課題研究不僅補(bǔ)充了香菇多糖抗腫瘤分子機(jī)制的理論基礎(chǔ),且有助于其作為功能性食品及抗腫瘤臨床用藥的開發(fā)應(yīng)用。第一部分香菇多糖SLNT的制備香菇多糖的制備沿用本課題組已建立并優(yōu)化的工藝技術(shù):采用水提醇沉法從房縣小香菇子實(shí)體中提取香菇粗多糖,再經(jīng)H_2O_2脫色法除去色素及部分雜質(zhì)得到脫色后多糖,最后通過超濾法分離純化得到精制香菇多糖,經(jīng)冷凍干燥后為白色絮狀物,性狀穩(wěn)定。對(duì)提取的香菇多糖進(jìn)行純度及分子量鑒定:苯酚 硫酸法檢測(cè)精制香菇多糖的糖含量約為98.54%;高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)測(cè)得精制香菇多糖的重均分子量約為6.23×10~5 Da,且分子量均一;紫外掃描結(jié)果顯示其幾乎不含蛋白質(zhì)和核酸。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,香菇多糖的提取工藝成熟可靠、易于控制、結(jié)果穩(wěn)定;提取得到的精制香菇多糖(SLNT)分子量均一、純度高、幾乎不含其它雜質(zhì),滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。第二部分香菇多糖對(duì)人HT-29結(jié)腸癌體內(nèi)外的非免疫途徑抗腫瘤作用研究結(jié)腸癌是全球癌癥致死數(shù)量排名第二的癌癥,每年約有100多萬新增病例和約50多萬死亡病例。目前臨床上主要通過手術(shù)切除病灶并通過化學(xué)療法進(jìn)行治療。盡管化學(xué)治療有助于緩解癥狀、延長(zhǎng)病患的生命,但是其不可避免的副作用(如腹瀉、惡心、嘔吐、急性心肌梗死、腦血管傷害等)極大地降低了病患的生活質(zhì)量,嚴(yán)重的甚至可能威脅生命。因此,尋找篩選具有低毒、高效抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物變得十分重要。本論文選用了來源為人結(jié)腸癌原發(fā)灶、屬于TNMⅠ期結(jié)腸癌、在裸鼠及NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤性極好、且多種癌基因表達(dá)呈陽性的人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系作為研究載體,探究了天然產(chǎn)物香菇多糖對(duì)人HT-29結(jié)腸癌體內(nèi)外的非免疫途徑直接抗腫瘤作用。通過MTT比色法考察了香菇多糖(SLNT)對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞體外增殖的抑制作用。結(jié)果顯示,將不同濃度香菇多糖(12.5-1600μg/mL)與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后,HT-29細(xì)胞的增殖均被顯著抑制,且隨著香菇多糖濃度增加,抑制率增加,具有一定劑量依賴性。當(dāng)香菇多糖濃度為1600μg/mL時(shí),抑制率達(dá)到66.84%,抗腫瘤作用顯著,僅次于陽性對(duì)照組氟尿嘧啶(800μg/mL)的抑制率74.24%。通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)香菇多糖組中大量細(xì)胞體積變小、貼壁不緊密、與周圍細(xì)胞連接消失、細(xì)胞質(zhì)濃縮;而正常細(xì)胞貼壁緊密,成團(tuán)生長(zhǎng),細(xì)胞質(zhì)未出現(xiàn)濃縮。建立T淋巴細(xì)胞缺陷的HT-29荷瘤裸鼠模型,探究香菇多糖是否能發(fā)揮T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)非依賴的抗腫瘤作用。采用皮下注射HT-29細(xì)胞植瘤建立荷瘤裸鼠模型,并隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(NC,注射等體積生理鹽水),陽性對(duì)照組(5-FU,20 mg/kg氟尿嘧啶),香菇多糖低、中、高劑量組(0.2、1.0、5.0 mg/kg SLNT);每組6只,采取尾靜脈注射方式,隔天給藥,共給藥10次,同時(shí)記錄裸鼠體重及腫瘤體積大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)離體腫瘤組織及脾臟稱重,計(jì)算脾指數(shù)、抑瘤率,并檢測(cè)裸鼠血清中IL-6及TNF-α的水平。結(jié)果顯示,香菇多糖各劑量組裸鼠體重在正常范圍內(nèi),而氟尿嘧啶組體重嚴(yán)重低于正常水平;低、中、高劑量香菇多糖對(duì)HT-29荷瘤裸鼠移植瘤的抑制率分別為17.88%、48.87%和57.90%,具有一定劑量依賴性;氟尿嘧啶的抑制率為67.23%,表明香菇多糖能發(fā)揮T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)非依賴的抗腫瘤作用。且與陰性對(duì)照組相比,香菇多糖各劑量對(duì)裸鼠的脾指數(shù)及血清中IL-6的水平無明顯影響,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明香菇多糖未提高其他免疫系統(tǒng)功能;而結(jié)果又顯示,香菇多糖顯著增加了血清中TNF-α的水平,我們猜測(cè)香菇多糖的抗腫瘤作用可能與腫瘤壞死因子有一定關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步排除香菇多糖免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)其直接抗腫瘤作用的影響,我們采用了T、B、NK細(xì)胞缺陷且巨噬細(xì)胞及補(bǔ)體系統(tǒng)等受損的聯(lián)合免疫缺陷NOD/SCID小鼠作為動(dòng)物模型,并選用與裸鼠實(shí)驗(yàn)中相同的給藥方式及劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(NC,注射等體積生理鹽水)、香菇多糖低劑量組(1.0 mg/kg SLNT)及香菇多糖高劑量組(5.0 mg/kg SLNT);每組5只,采取尾靜脈注射,隔天給藥,共給藥10次,同時(shí)記錄小鼠體重及腫瘤體積大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,計(jì)算脾指數(shù)、抑瘤率、評(píng)估香菇多糖的毒副作用,并檢測(cè)NOD/SCID小鼠血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ及TNF-α水平。結(jié)果顯示,香菇多糖治療對(duì)小鼠未產(chǎn)生毒副作用;香菇多糖(1 mg/kg and 5mg/kg)各劑量對(duì)HT-29荷瘤聯(lián)合免疫缺陷NOD/SCID小鼠移植瘤的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用,抑瘤率分別為45.05%和50.61%;且香菇多糖給藥未刺激小鼠脾指數(shù)及其血清中IL-2、IL-12、IL-6、IFN-γ水平的上調(diào),證明香菇多糖在免疫系統(tǒng)功能缺失的情況下抑制了HT-29移植瘤的生長(zhǎng),即發(fā)揮了其非免疫途徑的直接抗腫瘤作用。而與裸鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似的,香菇多糖高劑量組顯著上調(diào)了小鼠血清中TNF-α的水平,提示TNF-α可能參與了香菇多糖的直接抗腫瘤作用�？偠灾�,本部分研究證實(shí)了香菇多糖對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞發(fā)揮了非免疫途徑的直接抗腫瘤作用,且其抑瘤效果顯著。并且通過兩種免疫缺陷動(dòng)物模型,證實(shí)了香菇多糖同樣能在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮其T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)非依賴性的,甚至免疫系統(tǒng)非依賴的直接抗腫瘤作用。為后文香菇多糖非免疫途徑抗腫瘤作用的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。第三部分香菇多糖誘導(dǎo)人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡作用的研究由于細(xì)胞凋亡(Ⅰ型程序性死亡)被公認(rèn)為是最主要的導(dǎo)致細(xì)胞死亡的分子機(jī)制,于是本部分我們通過多種手段及技術(shù)探究了香菇多糖是否能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其直接抗腫瘤活性。首先,通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)400、800、1600μg/mL SLNT與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后,HT-29細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)到20.26%、31.80%、48.50%,均明顯高于陰性對(duì)照組(NC,7.31%),且具有一定劑量依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果,我們通過DAPI染色法、AO/EB及Annexin V-FITC/PI雙熒光染色法觀察了SLNT對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響。DAPI染色法可見SLNT組細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核固縮(呈致密濃染藍(lán)色熒光)及核碎裂,可見半球狀、新月牙狀細(xì)胞核,呈典型凋亡細(xì)胞核形態(tài),而NC組細(xì)胞核完整,染色均勻一致;AO/EB染色法可見SLNT組細(xì)胞核被染成綠色、黃綠色或橘紅色且呈固縮狀或圓珠狀,細(xì)胞核碎裂,而NC組細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整,著綠色且均勻一致;Annexin V-FITC/PI染色可見SLNT組出現(xiàn)綠色或紅色的早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞,且隨著劑量增加,凋亡細(xì)胞增多。最后,我們檢測(cè)了線粒體凋亡發(fā)生早期的標(biāo)志性事件—線粒體膜電位下降。結(jié)果顯示,香菇多糖顯著降低了HT-29細(xì)胞線粒體膜電位。以上研究結(jié)果證明了香菇多糖能顯著誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮了其直接抗腫瘤作用。隨后,我們通過對(duì)裸鼠及NOD/SCID小鼠HT-29腫瘤組織進(jìn)行HE染色,初步考察了腫瘤組織中細(xì)胞凋亡的情況。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)SLNT組腫瘤組織中可見散布凋亡細(xì)胞(細(xì)胞體積縮小,胞質(zhì)致密、核固縮或碎裂等),且隨著劑量增加,凋亡區(qū)域面積加大,而NC組細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核完整呈圓形和橢圓形。表明在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,香菇多糖也可能誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用。總而言之,本部分研究證明了香菇多糖能顯著誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮了其非免疫途徑的直接抗腫瘤作用,也為下一部分的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。第四部分香菇多糖誘導(dǎo)人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究細(xì)胞凋亡主要由兩種途徑誘導(dǎo):內(nèi)源性途徑(線粒體凋亡通路)和外源性途徑(死亡受體凋亡通路)。由于上一部分結(jié)果發(fā)現(xiàn)香菇多糖顯著降低了HT-29細(xì)胞線粒體膜電位,提示香菇多糖激活了線粒體凋亡通路。因此,我們首先通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了香菇多糖對(duì)HT-29細(xì)胞及腫瘤組織中線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),香菇多糖給藥顯著激活了凋亡效應(yīng)酶Caspase-3及凋亡起始酶Caspase-9,并上調(diào)了胞漿中細(xì)胞色素C(Cytochrome c)的水平及Bax/Bcl-2的比值,表現(xiàn)為線粒體凋亡通路激活。隨后,我們?cè)u(píng)估了線粒體凋亡通絡(luò)上游刺激因子活性氧(ROS)的水平及其與凋亡的關(guān)系。流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡觀測(cè)發(fā)現(xiàn),香菇多糖顯著升高了HT-29細(xì)胞中ROS的水平,且具有劑量依賴性;而經(jīng)過活性氧抑制劑NAC預(yù)培養(yǎng)后,香菇多糖組的凋亡率由32.91±1.21%顯著降低至21.49±1.62%(~(***)p0.001);且抑制活性氧上升后,香菇多糖誘導(dǎo)的胞漿中Cytochrome c及Bax/Bcl-2比值的上調(diào)被阻斷了,上述結(jié)果表明活性氧的升高有利于香菇多糖誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞線粒體凋亡。但同時(shí)結(jié)果顯示,與NAC組相比(6.94±0.57%),NAC+SLNT組的凋亡率(21.49±1.62%)仍顯著增高,提示香菇多糖可能同時(shí)通過死亡受體途徑誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡。死亡受體凋亡通路可由腫瘤壞死因子受體(TNFR1)、凋亡相關(guān)因子(Fas)等與相應(yīng)配體(TNF-α、FasL等)結(jié)合而誘導(dǎo),從而激活下游凋亡起始酶Caspase-8,繼而活化凋亡效應(yīng)酶Caspase-3,引發(fā)細(xì)胞凋亡。我們運(yùn)用多種方法(免疫印跡、免疫組化、免疫熒光法)檢測(cè)了HT-29細(xì)胞及腫瘤組織中死亡受體凋亡通路相關(guān)蛋白的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SLNT顯著激活了凋亡效應(yīng)酶Caspase-8并抑制了NF-κB的活化。結(jié)合第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,香菇多糖明顯上調(diào)了裸鼠及NOD/SCID小鼠血清中TNF-α的水平,提示香菇多糖可能通過TNF-α/TNFR1途徑誘導(dǎo)死亡受體凋亡。因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)了HT-29細(xì)胞分泌TNF-α的水平。結(jié)果顯示細(xì)胞經(jīng)香菇多糖刺激后,其分泌的TNF-α水平顯著增高,表明表明香菇多糖有可能通過TNF-α/TNFR1途徑激活了死亡受體凋亡通路。前期結(jié)果已發(fā)現(xiàn)SLNT激活了HT-29細(xì)胞及腫瘤組織中的Caspase-3,但為了進(jìn)一步驗(yàn)證SLNT誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡是否通過Caspase-3激活介導(dǎo),我們使用Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,經(jīng)過Ac-DEVD-CHO預(yù)培養(yǎng)后,香菇多糖組的凋亡率由32.91±1.21%顯著降低至15.88±1.58%(~(***)p0.001),表明香菇多糖誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡極大程度上通過Caspase-3激活介導(dǎo)。而抑制了Caspase-3的激活后,Ac-DEVD-CHO+SLNT組的凋亡率(15.88±1.58%)仍比Ac-DEVD-CHO組(7.77±0.79%)高,提示香菇多糖較小程度上可能通過非Caspase-3激活的途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,有待進(jìn)一步探究。本部分研究證明香菇多糖同時(shí)激活了線粒體及死亡受體凋亡通路,并因此誘導(dǎo)了HT-29細(xì)胞及腫瘤組織的凋亡。其分子機(jī)制總結(jié)如下圖:(1)內(nèi)源性線粒體途徑—活性氧急劇增加,線粒體膜電位下降,Bax/Bcl-2比值增大促進(jìn)細(xì)胞色素C由線粒體釋放入胞漿,導(dǎo)致凋亡起始酶Caspase-9活化從而激活凋亡效應(yīng)酶Caspase-3,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)死亡受體途徑—上調(diào)TNF-α水平,激活TNF-α/TNFR1通路,抑制NF-κB炎癥反應(yīng),從而活化凋亡起始酶Caspase-8,激活凋亡效應(yīng)酶Caspase-3,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第五部分香菇多糖誘導(dǎo)人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞自噬作用及初步機(jī)制研究自噬(Autophagy)即“自食(self-eating)”,是除細(xì)胞凋亡(apoptosis)即“自殺(self-killing)”以外的另一種細(xì)胞自我“毀滅”的過程。自噬性細(xì)胞死亡也被歸Ⅱ型程序性死亡,也是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的一種分子機(jī)制。因此,本部分我們進(jìn)一步探討了香菇多糖是否誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞的自噬作用及其可能的分子機(jī)制。LC3是目前被廣泛認(rèn)可的自噬標(biāo)志蛋白,常被用于自噬的監(jiān)測(cè)。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí),彌散性分布于細(xì)胞胞漿中的LC3-I會(huì)被修飾加工,形成LC3-II并定位于自噬體,從而指示自噬體生成。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組相比,香菇多糖組的HT-29細(xì)胞及腫瘤組織中LC3-II顯著增加;且LC3免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,香菇多糖組細(xì)胞中綠色斑點(diǎn)(自噬體)較正常細(xì)胞明顯增多,表明香菇多糖顯著刺激了HT-29細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。同時(shí)免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示,香菇多糖顯著刺激了自噬體形成關(guān)鍵蛋白Beclin 1的上調(diào),再一次佐證了香菇多糖發(fā)揮了促進(jìn)HT-29細(xì)胞自噬體形成的作用。而自噬體的增加并不一定意味著自噬作用增強(qiáng),也有可能是由于自噬體與溶酶體融合受阻導(dǎo)致。因此,我們通過以下三個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)香菇多糖對(duì)HT-29細(xì)胞自噬流的影響:(1)檢測(cè)自噬降解過程的標(biāo)志蛋白p62,其含量降低表明自噬降解過程通暢;(2)mCherry-GFP-LC3B雙熒光標(biāo)記法,同時(shí)反映自噬體及自噬溶酶體的數(shù)量;(3)透射電鏡觀察自噬形態(tài)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,香菇多糖能促進(jìn)HT-29細(xì)胞中自噬流增強(qiáng),即激活了HT-29細(xì)胞自噬。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞及腫瘤組織中自噬相關(guān)蛋白的含量,結(jié)果顯示香菇多糖顯著降低了p-mTOR、PI3K、p-AKT的含量,而顯著增加了p-JNK及細(xì)胞中p-AMPK的含量。因此,推測(cè)香菇多糖可能通過以下途徑誘導(dǎo)了HT-29細(xì)胞自噬:(1)抑制PI3K/Akt通路并激活了AMPK通路,共同直接或間接地抑制了下游自噬負(fù)調(diào)控蛋白mTOR的活性,激活自噬。(2)激活了JNK蛋白,促進(jìn)其磷酸化Bcl-2/Bcl-X_L,使自噬關(guān)鍵蛋白Beclin 1與其解離,激活自噬�？偠灾�,本部分研究證實(shí)了香菇多糖能顯著誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞自噬,并對(duì)其內(nèi)在的分子機(jī)制做了初步的探索,更詳細(xì)全面的機(jī)制研究有待進(jìn)一步探索。第六部分香菇多糖誘導(dǎo)人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞自噬對(duì)其直接抗腫瘤作用的影響自噬作用不同于凋亡作用(Ⅰ型細(xì)胞程序性死亡),凋亡作用的最終結(jié)果是殺死細(xì)胞,而自噬作用對(duì)細(xì)胞生存的影響卻具有雙重性—既可保護(hù)又可殺傷腫瘤細(xì)胞。本部分研究承接第五部分,進(jìn)一步探討香菇多糖誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞自噬對(duì)其直接抗腫瘤作用的影響。我們選用了兩種公認(rèn)的自噬抑制劑3-甲基腺苷(3-MA)及氯喹(CQ)用于實(shí)驗(yàn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,自噬抑制劑氯喹及3-MA組對(duì)HT-29細(xì)胞的增殖基本無影響;而HT-29細(xì)胞經(jīng)過CQ或3-MA預(yù)培養(yǎng)后,香菇多糖對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制率由56.04%(SLNT)分別顯著降低至34.89%(SLNT+CQ)、37.63%(SLNT+3-MA),表明香菇多糖誘導(dǎo)的自噬作用有助于其對(duì)HT-29細(xì)胞的直接抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步探究自噬激活對(duì)香菇多糖體內(nèi)發(fā)揮直接抗腫瘤作用的影響,我們建立了自噬抑制的HT-29荷瘤NOD/SCID小鼠模型。采取皮下注射HT-29細(xì)胞植瘤,并隨機(jī)分為陰性對(duì)照組(NC,注射等體積生理鹽水)、自噬抑制劑氯喹組(5.0 mg/kg CQ)、香菇多糖組(5.0 mg/kg SLNT)、香菇多糖+氯喹組(5.0 mg/kg SLNT+5.0 mg/kg CQ);每組5只,采取尾靜脈注射,隔天給藥,共給藥10次,同時(shí)記錄小鼠體重及腫瘤體積大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)離體腫瘤組織稱重,計(jì)算抑瘤率并評(píng)估氯喹用藥的毒副作用。結(jié)果顯示,香菇多糖組對(duì)移植瘤的抑制率為50.61%,而當(dāng)其與氯喹聯(lián)用時(shí),抑瘤率顯著降低(~*p0.05)至35.23%。本部分研究證明了香菇多糖誘導(dǎo)的自噬作用有助于其對(duì)HT-29細(xì)胞的直接殺傷作用,即表現(xiàn)為自噬性細(xì)胞死亡(Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡)。總的來講,香菇多糖能夠通過激活人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡及自噬性死亡,而發(fā)揮其非免疫途徑的直接抗腫瘤作用。本論文的研究為香菇多糖作為新型抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床提供了充足的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【圖文】：

25圖 1-1 香菇多糖 SLNT 提取分離純化流程圖 1 Extraction, isolation and purification scheme of polysaccharide from Lenti果菇粗多糖-2 所示，，水提醇沉法提取的香菇粗多糖研磨后呈棕褐色，易吸多糖性狀、產(chǎn)率及糖含量，見表 1-1。

華 中 科 技 大 學(xué) 博 士 學(xué) 位 論 文表 1-1 不同批次香菇粗多糖的產(chǎn)量、產(chǎn)率及糖含量（n=3）Table 1-1 Yield and sugar content of crude polysaccharide of different batches (n=3)批次 香菇子實(shí)體 重量（g） 粗多糖 產(chǎn)量（g） 粗多糖 產(chǎn)率（%） 粗多糖 糖含量（%）1 250 2.6 1.04 52.72 250 2.8 1.12 45.03 250 2.4 0.96 54.4平均值 250 2.6 1.04 50.71.3.2 香菇多糖的分離及純化結(jié)果香菇粗多糖經(jīng)脫色后顏色變淺，呈淺黃色（圖 1-3）；超濾后，經(jīng)冷凍干燥得到精制香菇多糖 SLNT，呈白色絮狀物，易溶于水，性狀穩(wěn)定（圖 1-4）。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2608186