【摘要】：本論文共分為四章內(nèi)容。一、文獻(xiàn)研究本章是在對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行查閱和分析的基礎(chǔ)上,較為系統(tǒng)地歸納和總結(jié)了大棗主要活性成分及其生物活性,并對(duì)中醫(yī)脾虛證病理特征與動(dòng)物模型構(gòu)建研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,以期為大棗補(bǔ)脾益胃功效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究提供思路與參考,為大棗資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。二、基于腸道菌群和代謝組相關(guān)聯(lián)的大棗補(bǔ)脾益胃作用機(jī)制研究(一)基于苦寒瀉下致脾虛動(dòng)物模型的大棗補(bǔ)脾益胃作用機(jī)制研究1、采用番瀉葉建立脾虛大鼠模型,造模同時(shí)給藥大棗。給藥10天后,收集大鼠血液、尿液、脾臟和小腸組織,進(jìn)行血常規(guī)、生化指標(biāo)以及小腸組織病理分析,評(píng)價(jià)大棗對(duì)番瀉葉所致脾虛模型大鼠的保護(hù)作用。結(jié)果顯示,造模后大鼠體重增長(zhǎng)率、血清淀粉酶、D-木糖、胃泌素水平均顯著降低,脾臟指數(shù)、血清膽堿酯酶、生長(zhǎng)抑素水平顯著升高,血常規(guī)指標(biāo)有明顯改變,小腸部位出現(xiàn)損傷。給藥大棗后,上述指標(biāo)均趨于正常水平。表明大棗可能是通過(guò)調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及能量代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)其補(bǔ)脾益胃功效。2、采用代謝組學(xué)方法確定與大鼠脾虛模型相關(guān)的代謝變化以及大棗的干預(yù)作用。共鑒定出31種差異內(nèi)源性代謝物(血漿22種,尿液9種),給予不同劑量的大棗后,27種代謝差異物不同程度地趨向正常水平(P0.05),這些內(nèi)源性代謝物主要參與視黃醇代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化代謝、煙酸和煙酰胺代謝、醚脂代謝和硒氨基酸代謝途徑。結(jié)果提示,大棗對(duì)番瀉葉所致脾虛大鼠有較好的調(diào)控作用,并從代謝組學(xué)方面揭示了大棗補(bǔ)脾益胃功效的潛在生物學(xué)機(jī)制。3、采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)研究番瀉葉致脾虛大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性,并探究大棗對(duì)脾虛大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用。LEfSe分析結(jié)果顯示,與空白組相比,脾虛模型組大鼠糞便中從門到屬分類水平上均發(fā)現(xiàn)差異菌群。在屬分類的菌群中共發(fā)現(xiàn)31個(gè)差異菌屬,給藥大棗后,能顯著改善脾虛引起的Allobaculum、Turicibacter、棒桿菌屬、變形菌屬、氣球菌屬、腸球菌屬、Epulopiscium、摩根氏菌屬、柯林斯氏菌屬和短小芽孢桿菌屬相對(duì)豐度升高。提示大棗可通過(guò)改善脾虛大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)失調(diào)達(dá)到治療作用。4、應(yīng)用R語(yǔ)言對(duì)鑒定出的31種潛在生物標(biāo)志物和腸道菌差異菌群(門和屬水平)計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)生成相關(guān)矩陣,構(gòu)建脾虛病理狀態(tài)下腸道微生物與宿主代謝組交互關(guān)系圖。結(jié)果顯示,氣球菌屬與尿液中潛在生物差異物煙酸胺、17α-hydroxypregnenolone、維生素A呈正相關(guān),而大棗能顯著降低氣球菌屬的相對(duì)豐度。推測(cè)脾虛瀉下造成的氣球菌屬相對(duì)豐度升高,而其升高后又通過(guò)影響視黃醇代謝、煙酸和煙酰胺代謝推動(dòng)脾虛的病理進(jìn)程,氣球菌屬可能是預(yù)測(cè)和治療脾虛和相關(guān)紊亂代謝通路的候選菌種。(二)基于炎癥性腸病動(dòng)物模型的大棗補(bǔ)脾益胃功效物質(zhì)及作用機(jī)制研究1、利用5%葡聚糖硫酸鈉,建立炎癥性腸病大鼠模型,給藥大棗及各化學(xué)組分后,均可回調(diào)模型組大鼠的DAI值,改善血常規(guī)指標(biāo),顯著降低結(jié)腸組織中炎癥相關(guān)因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量,減輕結(jié)腸組織損傷。各給藥組對(duì)炎癥性腸病的相關(guān)指標(biāo)的干預(yù)作用不完全一致,提示大棗不同化學(xué)組分對(duì)炎癥性腸病大鼠的調(diào)節(jié)作用呈現(xiàn)出一定的差異性,推測(cè)大棗發(fā)揮改善炎癥性腸病作用的機(jī)制為其各化學(xué)組分的共同作用。2、采用代謝組學(xué)研究方法研究與炎癥性腸病相關(guān)的代謝變化和大棗及各化學(xué)組分的干預(yù)作用。共鑒定出43種差異內(nèi)源性代謝物(血漿13種,尿液30種),主要涉及煙酸和煙酰胺代謝、泛酸和CoA生物合成、花生四烯酸代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化等代謝途徑,與番瀉葉所致脾虛模型有部分重合。大棗及各化學(xué)組分干預(yù)后,對(duì)部分差異內(nèi)源性代謝物具有回調(diào)作用,但各組分作用趨勢(shì)不完全一致,其中高劑量大棗調(diào)控差異代謝物的數(shù)量最多。利用Western blotting技術(shù)對(duì)花生四烯酸代謝通路進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)大棗及其各化學(xué)組分能不同程度顯著抑制通路中PLA2、COX2和5-LOX蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示,大棗具有較好的改善炎癥性腸病作用,推測(cè)其物質(zhì)基礎(chǔ)為各化學(xué)組分的共同作用,并從內(nèi)源性代謝物角度揭示了大棗改善炎癥性腸病的可能作用機(jī)制。3、采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)研究大棗及各化學(xué)組分對(duì)炎癥性腸病大鼠腸道不同部位菌群多樣性的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn),炎癥性腸病大鼠盲腸部位腸道菌群整體結(jié)構(gòu)未有顯著改變,菌群多樣性從結(jié)腸部位開始發(fā)生顯著紊亂,且結(jié)腸內(nèi)容物與糞便均找出差異菌屬27種,約有50%重合。高劑量大棗總提物與三萜酸組分對(duì)結(jié)腸部位腸道菌群有較好的調(diào)節(jié)作用,大棗及各化學(xué)組分均可不同程度地改善失衡的糞便菌群結(jié)構(gòu)。4、應(yīng)用R語(yǔ)言對(duì)鑒定出的43種潛在生物標(biāo)志物和差異菌群(門和屬水平)計(jì)算皮爾遜相關(guān)系數(shù)生成相關(guān)矩陣,構(gòu)建炎癥性腸病狀態(tài)下腸道微生物與宿主代謝組交互關(guān)系圖。結(jié)果顯示理研菌屬與4,6-二羥基喹啉、尿刊酸、煙酸單核苷酸呈正相關(guān),在炎癥性腸病大鼠中理研菌屬的相對(duì)豐度顯著降低。推測(cè)炎癥性腸病導(dǎo)致其相對(duì)豐度降低,從而影響到腸道屏障功能以及組氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝,推動(dòng)了炎癥性腸病的發(fā)展,理研菌屬可能是預(yù)測(cè)和治療炎癥性腸病和相關(guān)紊亂代謝通路的候選菌種。三、基于小鼠胃腸道系統(tǒng)的大棗與巴豆霜配伍減毒機(jī)制研究1、基于正常小鼠,通過(guò)尿量測(cè)定、生化指標(biāo)檢測(cè)以及小腸組織病理分析,研究大棗對(duì)巴豆霜胃腸毒性及利尿效應(yīng)的干預(yù)作用。結(jié)果表明,大棗與巴豆霜合用可減緩巴豆霜的快速利尿作用,顯著上調(diào)單用巴豆霜后下降的血清白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、胃泌素(GAS)和生長(zhǎng)抑素(SS)水平,減輕巴豆霜導(dǎo)致的小鼠小腸組織損傷。研究結(jié)果提示大棗與巴豆霜配伍應(yīng)用可在血清免疫指標(biāo)、腸道運(yùn)動(dòng)、腸道損傷等方面表現(xiàn)出一定的配伍減毒作用趨勢(shì)。此外,大棗尚可減緩巴豆霜的逐水藥勢(shì),呈現(xiàn)出一定的降效作用。2、基于正常小鼠,利用16S rDNA測(cè)序方法研究巴豆霜和大棗配伍前后腸道菌群的變化。結(jié)果表明,大棗與巴豆霜合用可改善巴豆霜引起的腸道菌群失調(diào)。大棗合用低劑量巴豆霜后可使升高的鞘氨醇單胞菌屬、顫螺菌屬的相對(duì)豐度顯著降低,大棗合用高劑量巴豆霜后致病菌屬嗜膽菌屬水平降低。研究結(jié)果提示大棗與巴豆霜配伍應(yīng)用可在腸道菌群結(jié)構(gòu)方面表現(xiàn)出一定的配伍減毒作用趨勢(shì)。四、大棗三萜酸類活性組分的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究1、建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC-MS/MS)方法,用于同時(shí)測(cè)定正常和免疫抑制大鼠血漿樣品中的7種大棗三萜酸類組分。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示,7種三萜酸成分在血漿中的線性關(guān)系良好,精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)以及穩(wěn)定性均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。結(jié)果顯示,在免疫抑制病理狀態(tài)下,表美洲茶酸的AUCo-t和AUC0～∞顯著高于正常大鼠,CLz/F顯著降低;麥珠子酸AUC0-t、AUC0～∞和Cmax顯著低于正常大鼠,而CLz/F則顯著高于正常大鼠。該結(jié)果將為大棗三萜酸類組分免疫調(diào)節(jié)臨床應(yīng)用提供參考。2、利用已建立的UHPLC-MS/MS方法同時(shí)定量測(cè)定正常和四氯化碳誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠模型血漿樣品中的7種大棗三萜酸類組分。結(jié)果表明,模型組與正常組之間7種三萜酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)存在顯著差異。在急性肝損傷病理狀態(tài)下,表美洲茶酸和坡模堤酮酸的AUC0-t和AUC0-∞顯著高于正常大鼠,其CLz/F則顯著降低。與之相反,麥珠子酸、白樺脂酸和白樺脂酮酸的參數(shù)呈現(xiàn)出截然不同的趨勢(shì)。該藥代動(dòng)力學(xué)研究將為大棗三萜酸類組分防治肝損傷臨床應(yīng)用提供參考。
【圖文】：

圖２－１－２小腸病理切片ＨＥ染色圖（ｘ邋２００倍）逡逑（＃Ｐ＜０．０５：模型組ｖｓ正常組；＊＊尸＜０．０１：給藥組ｖｓ模型組）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１－２邋Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｓｍａｌｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋（ｘ邋２００）逡逑ＣＰ＜邋０．０５：邋ｍｏｄｅｌｓ邋ｖｓ邋ｃｏｎｔｒｏｌｓ；邋＊＊Ｐ＜邋0．0ｌ：邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｇｒｏｕｐｓ邋ｖｓ邋ｍｏｄｅｌｓ）逡逑４討論逡逑本實(shí)驗(yàn)基于中醫(yī)理論之“苦寒傷脾”，采用番瀉葉所致脾虛經(jīng)典動(dòng)物模型，選擇血常規(guī)、逡逑臟器指數(shù)、病理切片及系列與脾虛模型密切相關(guān)的生理生化指標(biāo)，評(píng)價(jià)大棗補(bǔ)脾益胃?jìng)鹘y(tǒng)逡逑功效。結(jié)果顯示：大棗能提高淀粉酶活力，淀粉酶為消化和吸收糖類的關(guān)鍵酶，其活力的逡逑提高意味著大棗能增強(qiáng)脾虛大鼠對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝與吸收，改善其消化功能［２，３］；大棗能提逡逑高胃泌素含量，從而刺激胃酸、胃蛋白酶、胰酶的分泌［４１，促進(jìn)胃竇的收縮，增加Q懻襯さ膩義狹髁�，并且营养钨xΦ賴惱襯ぃ郟擔(dān)叮藎淮笤娼檔蛻ひ炙睪浚�，磦蝤减蓚R暈概趴蘸托〕θ潿義系囊種譜饔�，澡幷n桿帷⑽傅鞍酌傅姆置諞約靶〕Χ蘊(yùn)妓銜鎩被岬扔鎦實(shí)奈義鮮眨郟�，ＡP藎淮笤婺芙檔脫褐邪紫赴�、提高淋巴细胞比率，以澡幙免疫力、缓解炎症；大择w義夏芑航餛⑿樵斐傻男〕ψ櫓鶘耍逑殖齔Φ辣；さ淖饔謾Ｍ撇獯笤嬙ü鶻諳低場(chǎng)㈠義廈庖呦低騁約澳芰看�，以达抵v蠱⒁嫖傅男Ч�。辶x

本文編號(hào)：2608103