發(fā)布時間：2020-03-30 01:07

【摘要】：目的建立Huh7肝癌干細胞的培養(yǎng)體系并研究雷公藤紅素抑制Huh7肝癌干細胞的作用機制。方法1.通過懸浮傳代培養(yǎng)的方法培養(yǎng)獲得Huh7肝癌干細胞樣細胞,并鑒定獲得的肝癌干細胞樣細胞具有腫瘤干細胞的特性。(1)用Hoechst33342和Rhodamine123染料分別染色經懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞和普通的Huh7細胞,比較兩種細胞對染料的外排能力。(2)用流式細胞儀檢測經懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞與普通Huh7細胞的細胞周期,比較兩種細胞細胞周期的差異。(3)用Transwell體外侵襲實驗比較經懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞與普通Huh7細胞的侵襲能力,比較兩種細胞侵襲能力的差異。(4)Western blot方法分別檢測經懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞與普通Huh7細胞干性蛋白的表達,比較兩種細胞干性蛋白表達的差異。(5)裸鼠體內致瘤能力實驗比較經懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞與普通Huh7細胞致瘤能力的差異。2.雷公藤紅素抑制Huh7肝癌干細胞的作用機制研究。(1)不同濃度的雷公藤紅素分別處理Huh7細胞(16、8、4、2、1、0.5μM)和Huh7干細胞(32、16、8、4、2、1μM),CCK-8法分別于24h,48h,72h檢測細胞活性。(2)0、1.5μM雷公藤紅素分別處理Huh7細胞48h,流式細胞儀檢測細胞周期。(3)不同濃度的雷公藤紅素(0、1、2、4μM)分別處理Huh7細胞48h,流式細胞儀檢測細胞凋亡。(4)不同濃度的雷公藤紅素(0、1、2、4μM)分別處理第一代Huh7肝癌干細胞,72h后觀察第一代Huh7肝癌干細胞的成球情況。(5)不同濃度的雷公藤紅素(0、3、6、12μM)分別處理Huh7肝癌干細胞,48h后提取各處理組細胞蛋白,Western blot方法檢測干性蛋白的表達。(6)不同濃度的雷公藤紅素(0、3、6、12μM)分別處理Huh7肝癌干細胞,48h后提取各處理組細胞蛋白,Western blot方法檢測Wnt/β-catenin信號通路上關鍵蛋白的表達。結果1.與普通肝癌Huh7細胞相比較(1)懸浮傳代培養(yǎng)得到的Huh7肝癌干細胞樣細胞對Hoechst33342和Rhodamine123染料不敏感。(2)懸浮傳代培養(yǎng)得到的Huh7肝癌干細胞樣細胞中處于G0期的細胞比例明顯增多。(3)懸浮傳代培養(yǎng)得到的Huh7肝癌干細胞樣細胞具有更強的體外侵襲能力。(4)懸浮傳代培養(yǎng)得到的Huh7肝癌干細胞樣細胞干性蛋白的表達明顯增多。(5)懸浮傳代培養(yǎng)得到的Huh7肝癌干細胞樣細胞裸鼠體內致瘤能力更強。2.(1)雷公藤紅素可以明顯的抑制Huh7細胞和Huh7干細胞的增殖,且呈明顯的劑量依賴性和較明顯的時間依賴性。(2)1.5μM的雷公藤紅素可以明顯的將Huh7細胞阻滯在S期。(3)雷公藤紅素可以劑量依賴性的誘導Huh7細胞的凋亡。(4)雷公藤紅素可以劑量依賴性的抑制第一代Huh7肝癌干細胞的成球。(5)雷公藤紅素可以劑量依賴性的抑制干性蛋白Sox2、Klf4、Oct4的表達。(6)雷公藤紅素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的p-β-catenin、Cyclin D1蛋白抑制Huh7肝癌干細胞的增殖。結論1.懸浮傳代培養(yǎng)所得Huh7肝癌干細胞樣細胞有類似腫瘤干細胞的特性。2.雷公藤紅素通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制Huh7肝癌干細胞的增殖。
【圖文】：

(e) (f)圖 1-2：細胞對 Hoechst33342 和 Rhodamine123 染料敏感性。(a)Hoechst 33342（普 通 的 Huh7 細 胞 染 色 1h 后 流 式 細 胞 儀 在 400nm 波 長 條 件 下 檢 測 的(b)Hoechst33342(5μg/mL)對懸浮傳代培養(yǎng)得到的 Huh7 肝癌干細胞樣細胞染色 1儀在 400nm 波長條件下檢測的吸收峰，(c)Rhodamine123（1μg/mL）對普通的 H1h 后流式細胞儀在 480nm 波長條件下檢測的吸收峰，(d)Rhodamine123(1μg/mL培養(yǎng)得到的 Huh7 肝癌干細胞樣細胞染色 1h 后流式細胞儀在 480nm 波長條件下峰，，(e)Hoechst 33342染色實驗的統(tǒng)計結果，(f)Rhodamine123染色實驗的統(tǒng)計結果與普通 Huh7 細胞組比較。Fig.1-2:Dying assay.Primary hepatoma cells Huh7 and induced pluripotent stem ceincubated at Hoechst33342 and Rhodamine123 with a final concentration of 5μg/m

analysis using the flow cytometer at the wavelength of 400nm and 480nmresult of primary hepatoma cells Huh7,(b)(d)the result of induced pluHuh7,(e)(f)the result of statistical analysis.**P<0.01,compared with primary h4.3 細胞周期檢測實驗按細胞周期檢測試劑盒的說明，分別處理了 Huh7 細胞和懸的 Huh7 肝癌干細胞樣細胞，然后用流式細胞儀分別檢測了兩組實驗結果如圖 1-3 所示，懸浮傳代培養(yǎng)得到的 Huh7 肝癌干細胞樣的細胞比例明顯增多（47.93±0.88% vs. 57.91±0.76%），即經懸浮Huh7 肝癌干細胞樣細胞更多的處于“休眠期”，與 Huh7 細胞組比計學意義（P<0.05）。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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1 李悅;張宇;曹良啟;薛平;胡以則;張大偉;;Hedgehog信號通路轉錄因子Gli2表達對肝癌進展和生存預后的影響[J];中華普通外科學文獻(電子版);2016年03期

2 劉序友;舒建昌;;Hedgehog信號通路與肝纖維化發(fā)病相關機制研究新進展[J];胃腸病學和肝病學雜志;2016年01期

3 葉因濤;王晨;孫蓓;;PD-1/PD-L1抑制劑在腫瘤免疫治療中的研究進展[J];中國腫瘤臨床;2015年24期

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本文編號：2606794