發(fā)布時(shí)間：2020-03-29 20:54

【摘要】：五味子中具有生物活性的木脂素組分是其具有神經(jīng)保護(hù)作用和改善認(rèn)知功能損傷的主要原因。但對(duì)五味子中木脂素組分治療AD的藥效成分及作用機(jī)制尚無(wú)系統(tǒng)且完整的研究。五味子木脂素組分在體內(nèi)代謝過(guò)程的研究也主要集中在正常大鼠的藥代動(dòng)力學(xué)及代謝物的鑒定。目前尚無(wú)關(guān)于五味子木脂素組分在AD大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律及藥代動(dòng)力學(xué)的研究,因此利用現(xiàn)代技術(shù)手段明確五味子木脂素組分治療AD的藥效成分及作用靶點(diǎn),對(duì)揭示五味子治療AD的作用機(jī)制研究是非常有意義的。本文對(duì)五味子中木脂素組分進(jìn)行分離純化及鑒定,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行血漿代謝組學(xué)研究、入血成分及代謝物分析、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)研究,以期全面深入的闡明五味子中木脂素組分治療AD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制,為新藥開發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持,同時(shí)為揭示中草藥潛在的多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑的作用模式提供一種新的研究策略。本論文研究?jī)?nèi)容主要包括以下5個(gè)方面:1.五味子木脂素組分的分離純化及鑒定利用正交試驗(yàn)以純化后總木脂素提取率、得率及含量為指標(biāo),分別對(duì)傳統(tǒng)溶劑熱提法和閃式提取法的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,利用大孔樹脂對(duì)提取液分別進(jìn)行純化。最終確定五味子木脂素組分的最佳提取純化工藝為:閃式提取法提取,以體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇為提取溶劑,料液比為1:19,提取電壓100 V,提取時(shí)間為100 s,提取液濃縮后經(jīng)大孔樹脂純化。而后根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立五味子中木脂素類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對(duì)純化物中五味子木脂素組分進(jìn)行了分析鑒定,初步鑒定出15種木脂素類化合物。2.Aβ25-35誘導(dǎo)AD大鼠的病理生理變化及血漿代謝組學(xué)研究AD的特點(diǎn)是進(jìn)行性認(rèn)知障礙,病理表現(xiàn)包括神經(jīng)纖維纏結(jié)、淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)元丟失。目前阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,臨床上也并沒(méi)有有效的治療藥物。動(dòng)物模型有助于了解疾病的發(fā)生和進(jìn)展,并可用于開發(fā)潛在的藥物。本文利用大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35溶液建立AD模型。采用Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、HE染色和免疫組化實(shí)驗(yàn)及血漿代謝組學(xué)方法,對(duì)所建立的AD大鼠模型病理生理及內(nèi)源性代謝輪廓變化進(jìn)行研究,結(jié)果表明,海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35對(duì)大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力均造成了不可逆的損傷,這種損傷在4周內(nèi)逐步加重,并在4周時(shí)達(dá)到頂峰,造模8周內(nèi)均處于穩(wěn)定的狀態(tài)。在建模8周內(nèi),模型大鼠海馬區(qū)Aβ蛋白不斷沉積進(jìn)而形成老年斑。隨著Aβ不斷的沉積,p-tau蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶和GSK-3β的含量也在建模8周內(nèi)逐步提高,而腦內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量則呈現(xiàn)逐步減少的狀態(tài)。同時(shí)AD大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)功能發(fā)生紊亂,主要涉及GABA、Ach、Glu、5-HT、DA以及NE。通過(guò)對(duì)建模8周內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)AD大鼠血漿代謝輪廓的研究,我們共鑒定出17個(gè)與AD相關(guān)的內(nèi)源性代謝物,發(fā)現(xiàn)AD大鼠體內(nèi)代謝紊亂主要涉及脂肪酸、鞘脂類、甾醇類代謝、維生素代謝和氨基酸代謝。3.五味子木脂素組分治療阿爾茨海默病的血漿代謝組學(xué)研究本文通過(guò)Morris水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了五味子中木脂素組分對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用。結(jié)果顯示,五味子木脂素組分能顯著改善AD大鼠受損的空間學(xué)習(xí)記憶能力,且其作用效果與多奈哌齊沒(méi)有顯著差異。為闡明其作用機(jī)制,我們進(jìn)一步研究了五味子木脂素組分對(duì)AD大鼠體內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白過(guò)度磷酸化、神經(jīng)遞質(zhì)及內(nèi)源性代謝物的調(diào)節(jié)作用,結(jié)果表明,五味子木脂素組分可減輕AD大鼠Aβ沉積、tau蛋白過(guò)度磷酸化及神經(jīng)元凋亡,并可通過(guò)上調(diào)GABA、Gly、5-HT和ACh含量,下調(diào)ACh E和Asp含量,緩解AD大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)紊亂。通過(guò)血漿代謝組學(xué)分析,共鑒定出15個(gè)與五味子木脂素組分調(diào)節(jié)改善學(xué)習(xí)和記憶障礙有關(guān)的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。這些生物標(biāo)志物主要涉及鞘脂類代謝、亞油酸代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。上述結(jié)果表明五味子木脂素組分能調(diào)節(jié)AD大鼠體內(nèi)多個(gè)代謝通路,進(jìn)而緩解神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激的神經(jīng)毒性影響。4.五味子木脂素組分治療阿爾茨海默病的藥效成分及作用靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析AD與其它慢性疾病一樣,均由多種基因或蛋白質(zhì)的異常表達(dá)引起的。因此,針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物很難有效治療這些復(fù)雜疾病。本文對(duì)AD大鼠體內(nèi)五味子木脂素組分可吸收入血的有效成分和代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,共鑒定了10種木脂素入血原型成分和39種代謝物。分析結(jié)果得知其主要代謝反應(yīng)途徑包括羥基化、去甲基化、還原、磷酸化和脫水反應(yīng)。在入血成分分析結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用靶向藥理學(xué)方法,共篩選出17個(gè)靶點(diǎn)為五味子木脂素組分入血原型成分和AD的共同作用靶點(diǎn),包括ACh E、i NOS、GSK3β和HMOX1等。對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)這17個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)還與AD相關(guān)的其它靶點(diǎn)具有相互作用,這些靶點(diǎn)被選為五味子木脂素組分治療AD的潛在作用靶點(diǎn),主要包括APP代謝、神經(jīng)遞質(zhì)及炎癥反應(yīng)等。為了進(jìn)一步揭示五味子木脂素組分減輕AD大鼠記憶和認(rèn)知功能損害的藥理作用機(jī)制,我們通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)及UPLC-QQQ-MS技術(shù)進(jìn)行了獨(dú)立的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),五味子木脂素組分對(duì)AD大鼠的APP代謝、NFTs、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和抗氧化系統(tǒng)均有一定的調(diào)節(jié)作用。5.五味子木脂素組分在AD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究聯(lián)合應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QQQ-MS技術(shù)建立了一種快速、靈敏、可靠的分析方法,可同時(shí)測(cè)定血液樣品中五味子木脂素組分的含量。利用該方法研究AD病理及健康狀態(tài)下10種木脂素類化合物的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn),分別得到正常大鼠和AD大鼠體內(nèi)這10種木脂素類化合物的藥-時(shí)曲線及相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,AD大鼠對(duì)10種木脂素類化合物的吸收顯著增加。表明在AD病理狀態(tài)下木脂素類化合物的藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律發(fā)生了的改變,也可能是其發(fā)揮治療作用的原因之一。上述研究結(jié)果為五味子木脂素組分用于治療AD的相關(guān)藥理或毒理學(xué)研究提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),也為闡明五味子治療AD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

五味子純化物中木脂素組分正離子模式下總離子流圖

五味子純化物中五味子醇甲（a）及標(biāo)準(zhǔn)品（b）的提取離子色譜及串聯(lián)質(zhì)譜圖
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285.5

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本文編號(hào)：2606505