【摘要】：五味子中具有生物活性的木脂素組分是其具有神經(jīng)保護作用和改善認知功能損傷的主要原因。但對五味子中木脂素組分治療AD的藥效成分及作用機制尚無系統(tǒng)且完整的研究。五味子木脂素組分在體內(nèi)代謝過程的研究也主要集中在正常大鼠的藥代動力學及代謝物的鑒定。目前尚無關于五味子木脂素組分在AD大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律及藥代動力學的研究,因此利用現(xiàn)代技術手段明確五味子木脂素組分治療AD的藥效成分及作用靶點,對揭示五味子治療AD的作用機制研究是非常有意義的。本文對五味子中木脂素組分進行分離純化及鑒定,并在此基礎上,進行血漿代謝組學研究、入血成分及代謝物分析、網(wǎng)絡藥理學及藥代動力學研究,以期全面深入的闡明五味子中木脂素組分治療AD的藥效物質基礎及其作用機制,為新藥開發(fā)提供有力的實驗技術支持,同時為揭示中草藥潛在的多化合物、多靶點、多途徑的作用模式提供一種新的研究策略。本論文研究內(nèi)容主要包括以下5個方面:1.五味子木脂素組分的分離純化及鑒定利用正交試驗以純化后總木脂素提取率、得率及含量為指標,分別對傳統(tǒng)溶劑熱提法和閃式提取法的提取工藝進行優(yōu)化,利用大孔樹脂對提取液分別進行純化。最終確定五味子木脂素組分的最佳提取純化工藝為:閃式提取法提取,以體積分數(shù)為80%的乙醇為提取溶劑,料液比為1:19,提取電壓100 V,提取時間為100 s,提取液濃縮后經(jīng)大孔樹脂純化。而后根據(jù)相關文獻建立五味子中木脂素類化合物的質譜數(shù)據(jù)庫,利用液質聯(lián)用技術,對純化物中五味子木脂素組分進行了分析鑒定,初步鑒定出15種木脂素類化合物。2.Aβ25-35誘導AD大鼠的病理生理變化及血漿代謝組學研究AD的特點是進行性認知障礙,病理表現(xiàn)包括神經(jīng)纖維纏結、淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)元丟失。目前阿爾茨海默病的發(fā)病機制尚不清楚,臨床上也并沒有有效的治療藥物。動物模型有助于了解疾病的發(fā)生和進展,并可用于開發(fā)潛在的藥物。本文利用大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35溶液建立AD模型。采用Morris水迷宮行為學實驗、HE染色和免疫組化實驗及血漿代謝組學方法,對所建立的AD大鼠模型病理生理及內(nèi)源性代謝輪廓變化進行研究,結果表明,海馬CA1區(qū)注射Aβ25-35對大鼠學習及記憶能力均造成了不可逆的損傷,這種損傷在4周內(nèi)逐步加重,并在4周時達到頂峰,造模8周內(nèi)均處于穩(wěn)定的狀態(tài)。在建模8周內(nèi),模型大鼠海馬區(qū)Aβ蛋白不斷沉積進而形成老年斑。隨著Aβ不斷的沉積,p-tau蛋白、β-分泌酶、γ-分泌酶和GSK-3β的含量也在建模8周內(nèi)逐步提高,而腦內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量則呈現(xiàn)逐步減少的狀態(tài)。同時AD大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質功能發(fā)生紊亂,主要涉及GABA、Ach、Glu、5-HT、DA以及NE。通過對建模8周內(nèi)不同時間點AD大鼠血漿代謝輪廓的研究,我們共鑒定出17個與AD相關的內(nèi)源性代謝物,發(fā)現(xiàn)AD大鼠體內(nèi)代謝紊亂主要涉及脂肪酸、鞘脂類、甾醇類代謝、維生素代謝和氨基酸代謝。3.五味子木脂素組分治療阿爾茨海默病的血漿代謝組學研究本文通過Morris水迷宮行為學實驗評估了五味子中木脂素組分對AD大鼠認知功能障礙的改善作用。結果顯示,五味子木脂素組分能顯著改善AD大鼠受損的空間學習記憶能力,且其作用效果與多奈哌齊沒有顯著差異。為闡明其作用機制,我們進一步研究了五味子木脂素組分對AD大鼠體內(nèi)Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化、神經(jīng)遞質及內(nèi)源性代謝物的調(diào)節(jié)作用,結果表明,五味子木脂素組分可減輕AD大鼠Aβ沉積、tau蛋白過度磷酸化及神經(jīng)元凋亡,并可通過上調(diào)GABA、Gly、5-HT和ACh含量,下調(diào)ACh E和Asp含量,緩解AD大鼠體內(nèi)神經(jīng)遞質紊亂。通過血漿代謝組學分析,共鑒定出15個與五味子木脂素組分調(diào)節(jié)改善學習和記憶障礙有關的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。這些生物標志物主要涉及鞘脂類代謝、亞油酸代謝及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。上述結果表明五味子木脂素組分能調(diào)節(jié)AD大鼠體內(nèi)多個代謝通路,進而緩解神經(jīng)炎癥和氧化應激的神經(jīng)毒性影響。4.五味子木脂素組分治療阿爾茨海默病的藥效成分及作用靶點關聯(lián)分析AD與其它慢性疾病一樣,均由多種基因或蛋白質的異常表達引起的。因此,針對單一靶點的藥物很難有效治療這些復雜疾病。本文對AD大鼠體內(nèi)五味子木脂素組分可吸收入血的有效成分和代謝產(chǎn)物進行分析,共鑒定了10種木脂素入血原型成分和39種代謝物。分析結果得知其主要代謝反應途徑包括羥基化、去甲基化、還原、磷酸化和脫水反應。在入血成分分析結果的基礎上,采用靶向藥理學方法,共篩選出17個靶點為五味子木脂素組分入血原型成分和AD的共同作用靶點,包括ACh E、i NOS、GSK3β和HMOX1等。對這些靶點進一步分析,發(fā)現(xiàn)這17個目標靶點還與AD相關的其它靶點具有相互作用,這些靶點被選為五味子木脂素組分治療AD的潛在作用靶點,主要包括APP代謝、神經(jīng)遞質及炎癥反應等。為了進一步揭示五味子木脂素組分減輕AD大鼠記憶和認知功能損害的藥理作用機制,我們通過酶聯(lián)免疫檢測及UPLC-QQQ-MS技術進行了獨立的驗證性實驗,研究結果發(fā)現(xiàn),五味子木脂素組分對AD大鼠的APP代謝、NFTs、神經(jīng)遞質代謝、炎癥反應和抗氧化系統(tǒng)均有一定的調(diào)節(jié)作用。5.五味子木脂素組分在AD大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究聯(lián)合應用UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-QQQ-MS技術建立了一種快速、靈敏、可靠的分析方法,可同時測定血液樣品中五味子木脂素組分的含量。利用該方法研究AD病理及健康狀態(tài)下10種木脂素類化合物的藥動學特點,分別得到正常大鼠和AD大鼠體內(nèi)這10種木脂素類化合物的藥-時曲線及相應的動力學參數(shù)。結果顯示,與正常大鼠相比,AD大鼠對10種木脂素類化合物的吸收顯著增加。表明在AD病理狀態(tài)下木脂素類化合物的藥代動力學規(guī)律發(fā)生了的改變,也可能是其發(fā)揮治療作用的原因之一。上述研究結果為五味子木脂素組分用于治療AD的相關藥理或毒理學研究提供了可靠的實驗數(shù)據(jù),也為闡明五味子治療AD的藥效物質基礎和作用機制奠定了理論基礎。
【圖文】：

五味子純化物中木脂素組分正離子模式下總離子流圖

五味子純化物中五味子醇甲（a）及標準品（b）的提取離子色譜及串聯(lián)質譜圖
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284;R285.5

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本文編號：2606505