【摘要】：5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF)是美拉德反應(yīng)或焦糖化反應(yīng)的主要產(chǎn)物,是分子量為126.11的小分子化合物,廣泛存在于含糖的藥物、食物中。研究表明,5-HMF具有抗氧化、抗腫瘤、抗組織缺血等藥理作用,也具有腎毒性和潛在遺傳毒性。中華人民共和國(guó)藥典規(guī)定,5-HMF在葡萄糖注射液中限量為11.8μg·mL-1,前期分析了市面上在售的多批次中藥注射劑(Traditional Chinese MedicineInjections,TCMIs)中5-HMF的含量,一些注射劑中其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于此標(biāo)準(zhǔn)。此外,在含5-HMF濃度較高的注射液中還檢測(cè)到一定濃度的5-HMF聚合物,經(jīng)鑒定主要為5-HMF的二聚體,即雙-(5-甲酰基糠基)醚(5,5'-Oxydimethylenebis(2-furfural),OMBF)。隨著TCMIs在臨床上的廣泛應(yīng)用,其不良反應(yīng)報(bào)道也日益增加,其中發(fā)生率最高的為免疫介導(dǎo)的藥物超敏反應(yīng)(Immune-mediateddrug hypersensitivity reaction,IDHR),包括類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)和Ⅰ型超敏反應(yīng)。5-HMF聚合物是糖降解產(chǎn)生5-HMF單體的過(guò)程中常見(jiàn)的一種副產(chǎn)物,其潛在毒性尚未引起關(guān)注。本論文第一部分選用體外肥大細(xì)胞模型:大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞(Basophilic leukemia cell line 2H3,RBL-2H3)對(duì)5-HMF單體及其二聚體OMBF的潛在免疫毒性,包括類(lèi)過(guò)敏及Ⅰ型超敏反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。首先對(duì)RBL-2H3細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特性及脫顆粒激發(fā)條件進(jìn)行摸索,成功建立RBL-2H3肥大細(xì)胞活化脫顆粒模型。在此實(shí)驗(yàn)條件下,開(kāi)展5-HMF和OMBF直接誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒發(fā)生類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn),以及誘導(dǎo)致敏后的RBL-2H3細(xì)胞活化發(fā)生Ⅰ型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn),通過(guò)觀察RBL-2H3細(xì)胞形態(tài),測(cè)定β-氨基糖苷酶(β-Hexosaminidase,β-HEX)釋放率、組胺(Histamine,His)釋放率、Ca2+含量,以及不同濃度下對(duì)白介素6(Interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)生成的影響。主要結(jié)果如下:(1)RBL-2H3細(xì)胞最適鋪板密度為1×105個(gè)/mL,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在72小時(shí)內(nèi)完成;5-HMF 與 OMBF 的 IC50 分別為 4.96mM 和 5.35×10-2 mM,OMBF 的毒性大于 5-HMF,相差約100倍;(2)模型組造模濃度為0.5 μg/mL抗DNP-IgE單抗與細(xì)胞孵育過(guò)夜,100 ng/mL DNP-HSA激發(fā)細(xì)胞脫顆粒,此外選定孵育時(shí)間選為2 h,進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)開(kāi)展;(3)體外類(lèi)過(guò)敏免疫毒性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,5-HMF低劑量(0.1 IC50)、OMBF低劑量(0.1 IC50)組能顯著性促進(jìn)β-HEX和His的釋放,刺激IL-6的分泌,OMBF高劑量組(IC50)中,His釋放量、胞內(nèi)Ca2+濃度和TNF-α、IL-6的分泌量均顯著性升高;(4)體外Ⅰ型超敏免疫毒性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,5-HMF高劑量(10倍臨床最大暴露量)刺激下,β-HEX、His釋放率,TNF-α和IL-6分泌量均與空白對(duì)照有顯著性升高,OMBF高劑量組(10倍臨床最大暴露量)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生脫顆粒變化,β-HEX、His的釋放率和TNF-α的分泌,以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著性升高。我們可以得出結(jié)論,在利用RBL-2H3評(píng)價(jià)受試物的類(lèi)過(guò)敏免疫毒性實(shí)驗(yàn)中,5-HMF低劑量(0.1IC50),OMBF低(0.1IC50)、高劑量(IC50)均刺激肥大細(xì)胞活化脫顆粒,釋放活性介質(zhì),發(fā)生類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)。在評(píng)價(jià)Ⅰ型超敏免疫毒性實(shí)驗(yàn)中,5-HMF和OMBF以臨床最大暴露量10倍的濃度致敏BN大鼠,獲得血清孵育肥大細(xì)胞后,在IC50濃度下,刺激肥大細(xì)胞活化脫顆粒,發(fā)生Ⅰ型超敏反應(yīng),具有體外免疫毒性。我們先前的研究發(fā)現(xiàn),5-HMF和OMBF可能與含糖中藥注射液引發(fā)的免疫刺激(如超敏反應(yīng)和自身免疫反應(yīng))有一定的相關(guān)性,結(jié)合第一部分5-HMF和OMBF具有體外免疫毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本論文第二部分選取了 3種含有5-HMF和OMBF的中藥注射液:脈絡(luò)寧、生脈和丹香冠心,利用小鼠直接乆窩淋巴結(jié)(Direct-popliteal lymph node assay,D-PLNA)和報(bào)告抗原乆窩淋巴結(jié)(Reporter antigen-popliteal lymph node assay,RA-PLNA)對(duì)3種受試物進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)。主要研究?jī)?nèi)容為分別建立D-PLNA和RA-PLNA模型,報(bào)告抗原為三硝基苯基聚蔗糖(2,4,6-trinitropheny-Ficoll,TNP-Ficoll)和三硝基苯基卵蛋白(TNP-ovalbumin,TNP-OVA)。足趾部給藥后,測(cè)定足趾厚度,D7剖殺分離乆窩淋巴結(jié),制備淋巴單細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞指數(shù);將細(xì)胞懸液培養(yǎng)于孔板中,與刺激劑共孵育后,測(cè)定細(xì)胞上清液中免疫球蛋白IgE和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的含量變化。主要結(jié)果如下:(1)D-PLNA評(píng)價(jià)3種TCMIs免疫原性:丹香冠心注射液組給藥后足腫脹明顯,淋巴結(jié)計(jì)數(shù)顯著增加;脈絡(luò)寧、生脈注射液對(duì)小鼠乆窩淋巴結(jié)(Popliteal lymphnode assay,PLN)未產(chǎn)生明顯的陽(yáng)性反應(yīng)。(2)RA-PLNA評(píng)價(jià)3種TCMIs免疫原性:各給藥組與TNP-Ficoll作用時(shí),細(xì)胞數(shù)目和MCP-1濃度均顯著升高,與TNP-OVA作用時(shí),脈絡(luò)寧注射液能顯著性刺激IgE分泌,同時(shí)丹香冠心注射液IgE和MCP-1含量顯著性差異升高。脈絡(luò)寧和生脈注射液中存在小分子物質(zhì)誘發(fā)免疫反應(yīng),而丹香冠心注射液成分復(fù)雜,可能同時(shí)能直接誘導(dǎo)I型超敏反應(yīng),也有作為半抗原的小分子物質(zhì)與報(bào)告抗原結(jié)合誘發(fā)超敏反應(yīng)。綜上所述,本研究成功建立RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒模型,并對(duì)5-HMF和OMBF體外免疫毒性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),我們首次發(fā)現(xiàn)5-HMF和OMBF可能同時(shí)引起體外肥大細(xì)胞發(fā)生類(lèi)過(guò)敏反應(yīng)和I型超敏反應(yīng),二聚體OMBF的生成增加了 5-HMF的免疫毒性,PLNA的結(jié)果進(jìn)一步證明了 5-HMF及OMBF可能在中藥注射液中作為小分子半抗原與體內(nèi)蛋白相結(jié)合造成免疫系統(tǒng)的失調(diào)。對(duì)5-HMF和OMBF的體外免疫毒性評(píng)價(jià)以及對(duì)3種中藥注射劑的免疫原性評(píng)價(jià),為中藥注射劑的臨床不良反應(yīng)的防治提供新的依據(jù),同時(shí)對(duì)相關(guān)中藥注射液中小分子物質(zhì)5-HMF單體及二聚體OMBF的質(zhì)量控制和深入研究非常必要。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐碩士學(xué)位論文逡逑結(jié)果逡逑１邐ＲＢＬ－２Ｈ３細(xì)胞生長(zhǎng)曲線逡逑結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞濃度為５Ｘ邋１０ｓ個(gè)／ｎｉＬ時(shí)，細(xì)胞從ＤＯ開(kāi)始細(xì)胞數(shù)量維持在平臺(tái)逡逑期，未見(jiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；當(dāng)鋪版濃度為ＩＸ邋１０５個(gè)／ｒａＬ時(shí)，在Ｄ２時(shí)，細(xì)胞增殖達(dá)到第一逡逑個(gè)峰值，隨后Ｄ２－Ｄ４接近衰退，又進(jìn)入另一個(gè)生長(zhǎng)期；當(dāng)濃度為５Ｘ１０１個(gè)／ｍＬ時(shí)，逡逑與１Ｘ１０５個(gè)／ｍＬ生長(zhǎng)相似，只是在Ｄ３達(dá)到峰值。由此可知，ＲＢＬ－２Ｈ３細(xì)胞的鋪板濃逡逑度選為１邋Ｘ邐個(gè)／ｍＬ，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程在７２小時(shí)內(nèi)完成。逡逑

０邐１邐２邐３邐４邐５邐６逡逑ＴＩＭＥ（Ｄａｙ）逡逑圖１－１．ＲＢＬ－２Ｈ３細(xì)胞生長(zhǎng)曲線逡逑２邐５－ＨＭＦ和ＯＭＢＦ對(duì)ＲＢＬ－２Ｈ３細(xì)胞毒性逡逑半數(shù)抑制濃度（５０％ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＩＣ５。）是指在用藥后存活逡逑的細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需的藥物濃度；在ＭＴＴ法中，就是以對(duì)照組吸光度０Ｄ值逡逑減少一半所需的藥物濃度。由于５－ＨＭＦ和０ＭＢＦ的參考數(shù)據(jù)較少，所以測(cè)定二者的逡逑ＩＣ５Ｕ對(duì)后期實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的濃度有指導(dǎo)意義。逡逑５－ＨＭＦ邋的邋ＩＣ５。為邋４．９６邋ｍＭ邋（圖邋３．邋Ａ），邋０ＭＢＦ邋的邋１Ｃ＊為邋５＿邋３５Ｘｌ（Ｔ２ｍＭ邋（圖邋３．邋Ｂ），０ＭＢＦ逡逑與５－ＨＭＦ的ＩＣ５（）相差約９０倍，，在濃度相同時(shí)，０ＭＢＦ對(duì)細(xì)胞增值的抑制率要比５－ＨＭＦ逡逑大很多，即５－ＨＭＦ二聚體的生成增大了對(duì)ＲＢＬ－２Ｈ３的細(xì)胞毒性。逡逑２６逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2604996