【摘要】：研究背景隨著人口老齡化進(jìn)程的不斷加深,腦血管疾病已經(jīng)成為危害中老年人健康的常見病、多發(fā)病,因其發(fā)病具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn),故而腦缺血損傷后神經(jīng)的再生修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前越來越多的研究表明,若置于合適的微環(huán)境中,受損傷的神經(jīng)元軸突是可以再生的。中藥復(fù)方因其具有獨(dú)特的臨床療效,多元的作用靶點(diǎn),日益成為神經(jīng)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。通絡(luò)化痰膠囊在“化痰通絡(luò)湯”的基礎(chǔ)上總結(jié)優(yōu)化而成,目前已在臨床用于治療腦梗死。在前期研究基礎(chǔ)上,本文運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),研究通絡(luò)化痰膠囊對于Nogo-A、GAP-43蛋白表達(dá)情況以及膠質(zhì)細(xì)胞增生情況、Neurocan表達(dá)情況的影響,從而探討其對神經(jīng)軸突再生的影響,為推廣應(yīng)用于發(fā)生腦缺血損傷的創(chuàng)傷性失血性休克、創(chuàng)傷性彌漫性腦腫脹和蛛網(wǎng)膜下腔出血等疾病提供理論依據(jù)。研究目的1通過對腦缺血損傷后的MCAO模型大鼠應(yīng)用通絡(luò)化痰膠囊,研究不同濃度通絡(luò)化痰膠囊水溶劑對大鼠腦缺血損傷后Nogo-A蛋白、GAP-43蛋白表達(dá)的影響。2在體外實(shí)驗(yàn)中研究不同濃度的通絡(luò)化痰含藥血清對膠質(zhì)細(xì)胞增生情況以及與膠質(zhì)細(xì)胞增生高度相關(guān)的Neurocan因子表達(dá)情況的影響,從而探討其對神經(jīng)軸突再生的影響。研究方法1將48只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、通絡(luò)化痰膠囊低劑量組以及通絡(luò)化痰膠囊高劑量組。造模:實(shí)驗(yàn)組動物參照Koizumi法制作大鼠大腦中動脈缺血模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO),予大鼠頸前作前正中切口,細(xì)心游離頸總、頸外、頸內(nèi)動脈,結(jié)扎右側(cè)頸總動脈近心端、頸外動脈及頸內(nèi)動脈顳顎分支,僅保留頸內(nèi)動脈入顱主干。于頸總動脈分叉處插入4-0尼龍線,沿頸內(nèi)動脈推進(jìn)17～18mm時可感阻力,表明栓線頭己通過大腦中動脈起始處,實(shí)現(xiàn)大腦中動脈阻塞,扎緊頸動脈遠(yuǎn)心端縫線,尼龍線外留1cm,縫合皮膚,缺血1h后輕輕提拉殘留線頭至有阻力,提示尼龍線頭端已至頸總動脈切口處,實(shí)現(xiàn)大腦中動脈再灌注,造模完成。以大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征及對側(cè)肢體偏癱(前肢為重)為造模成功標(biāo)志。造模成功后每天低、高劑量組分別予通絡(luò)化痰膠囊溶液324mg/kg、648mg/kg灌胃,模型組予生理鹽水灌胃,空白組不作任何處理。于7天、14天兩個時間點(diǎn)分別處死各組大鼠6只并取腦,應(yīng)用免疫組化法檢測Nogo-A、GAP-43表達(dá)水平,采用圖像獲取分析軟件尼康NIS-ElementsD 3.0測定陽性表達(dá)物的平均光密度積分,所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件包處理,數(shù)據(jù)統(tǒng)一以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的形式表示,統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2將大鼠隨機(jī)分為正常組及通絡(luò)化痰膠囊組。其中通絡(luò)化痰膠囊組每天以通絡(luò)化痰水溶液648mg/kg灌胃1次,連續(xù)7天。第7天灌胃2小時后股動脈取血,4℃靜置,2000r/min離心10mins,取上清液,經(jīng)56℃,30mins滅活,滅菌,零下20℃保存。選取正常組血清以及通絡(luò)化痰膠囊灌胃組的血清分別制備10%,5%,2.5%血清濃度的培養(yǎng)基。對不同濃度含藥血清培養(yǎng)的大鼠原代細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn),待星形膠質(zhì)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底的時候,使用消毒后的200微升槍頭的尖部在培養(yǎng)皿底劃傷星形膠質(zhì)細(xì)胞,形成損傷帶,繼續(xù)培養(yǎng),觀察不同濃度含藥血清對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響,并應(yīng)用Western blot技術(shù)測定Neurocan的表達(dá)情況。研究結(jié)果1在構(gòu)建大鼠腦缺血再灌注模型,給予通絡(luò)化痰膠囊溶液灌胃后,與模型組同期相比通絡(luò)化痰膠囊高、低劑量組均能降低Nogo-A的表達(dá)(P0.05 或P0.01),上調(diào)GAP-43的表達(dá)(P0.05),但通絡(luò)化痰高、低劑量組之間上述2指標(biāo)的表達(dá)水平未見明顯差異。2從劃傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,盡管含藥血清對損傷的大鼠原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并未能產(chǎn)生完全的抑制作用,但用藥濃度梯度增加時,膠質(zhì)細(xì)胞仍表現(xiàn)出一定的生長抑制趨勢;對體外培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)21天含藥血清培養(yǎng)后總蛋白抽提檢測Neurocan,表明最高含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞中Neurocan蛋白的含量出現(xiàn)了一定程度的下降。研究結(jié)論通絡(luò)化痰膠囊能夠上調(diào)腦缺血區(qū)GAP-43蛋白表達(dá),抑制Nogo-A蛋白的表達(dá),具備一定的抑制膠質(zhì)瘢痕形成的能力,從而起到促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的作用。
【圖文】：

圖３造模后灌胃逡逑１．２．３

１．２．２動物分組與給藥逡逑雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠４８只，隨機(jī)分為正常組、模型組、通絡(luò)化痰膠囊低劑量（以逡逑下簡稱低劑量組）、通絡(luò)化痰膠囊高劑量組（以下簡稱高劑量組）等４組，每組逡逑１２只。模型組予ＭＣＡＯ造模，，不予任何治療。空白組不予造模及治療，飼養(yǎng)７逡逑天。高、低劑量組大鼠造模清醒后分別給予３２４ｍｇ／ｋｇ、６４８ｍｇ／ｋｇ通絡(luò)化痰膠囊逡逑灌胃。各組大鼠同期觀察７天、１４天。逡逑＾邋：逡逑＇Ｉ逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2605097