【摘要】：1型糖尿病(T1DM)的發(fā)病過程中,自身免疫的狀態(tài)起著非常重要的作用。間充質干細胞(MSCs)在之前的研究中被證實能夠有效的減輕自身免疫狀況,給T1DM的治療提供了新思路。目的:通過對初發(fā)T1DM的NOD小鼠應用臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)以及白藜蘆醇的聯合治療來觀察二者聯合對T1DM小鼠治療效果,探討聯合應用hUCMSCs與白藜蘆醇對于減輕自身免疫狀態(tài),保護β細胞,改善胰島功能的作用。方法:經檢測成模的實驗小鼠隨機分為以下幾組,并給與相應干預措施:(1)糖尿病對照組:于發(fā)病后不采用任何干預措施;(2)hUCMSCs組:于發(fā)病后第3天通過尾靜脈注射hUCMSC 1×106/只;(3)白藜蘆醇組:于發(fā)病后第三天起給與白藜蘆醇200mg/kg·d灌胃;(4)聯合治療組:于發(fā)病后第3天通過尾靜脈注射hUCMSC 1×106/只,同時給與白藜蘆醇200mg/kg·d灌胃;(5)胰島素組:于發(fā)病后給與甘精胰島素治療。(6)同時選取飼養(yǎng)9周后,未發(fā)病的NOD小鼠作為正常對照組。以發(fā)病當天記作第0天,分別于第7、14、21、28、35、42、49、56天稱量體重并檢測隨機血糖。ELISA法測治療前后空腹血清C肽。于發(fā)病56天處死小鼠,取血流式測定Th1/Th2細胞因子濃度,取脾臟流式測定CD4+CD5+Foxp3+T細胞(Treg)比例以及CD4+T細胞、CD8+T細胞比例,取胰腺制作冰凍切片,HE染色觀察胰島結構形態(tài)以及炎癥細胞浸潤情況。結果:1:一般情況觀察各組小鼠在確診糖尿病后,均出現飲水量、尿量增多的情況。糖尿病對照組較其他各組毛色晦暗且反應遲鈍。2:體重變化情況糖尿病對照組體重出現較大幅度的、迅速的下降;而在聯合治療組以及白藜蘆醇組小鼠體重在發(fā)病后并未出現過大波動;在單純hUCMSCs治療組,發(fā)病前期體重明顯下降,而后出現體重恢復,在49d時已經恢復到發(fā)病時體重,并且與正常組小鼠體重相當。3:不同時點血糖變化情況hUCMSCs組、白藜蘆醇組、聯合治療組在發(fā)病7d后血糖開始逐漸下降,與未治療的糖尿病組相比存在明顯的差異(P0.05)。hUCMSCs組、聯合治療組血糖控制效果明顯,而且逐漸趨于正常組,14d后已經與正常組水平相當(P0.05),這種治療效果一直持續(xù)到56d;聯合治療組以及白藜蘆醇治療組均能在早期實現應用少量胰島素保持血糖的較低水平,而hUCMSCs組在21-28天胰島素用量才開始下降。4:空腹血清C肽水平比較各組小鼠發(fā)病初期空腹血清C肽不存在顯著差異(P0.05),經過相應治療措施后,聯合治療組56d時空腹血清C肽較治療前上升,且差異具有顯著性(P0.05)。5:外周血清炎癥細胞因子水平比較與糖尿病對照組相比較,聯合治療組、hUCMSCs組外周血清中IL-5,IL-6含量均顯著升高(P0.05),IL-2,TNF-α,IFN-γ,IL-17水平顯著下降(P0.05),應用白藜蘆醇治療組可以明顯降低TNF-α,IFN-γ,IL-2,IL-17(P0.05),但對IL-5,IL-10效果不明顯(P0.05)。6:治療后脾臟淋巴細胞亞群以及Treg的比較hUCMSCs組、白藜蘆醇組以及聯合治療組Treg均較糖尿病對照組有所升高(P0.05),但聯合治療組Treg升高的程度較其他各組存在著顯著的差異(P0.05)。在56d糖尿病小鼠體內CD4+T細胞、CD8+T細胞均較正常組有顯著的增加(P0.05),而各種治療方式也都能夠明顯降低脾臟CD4+T細胞、CD8+T細胞水平,在hUCMSCs組、白藜蘆醇組與聯合治療組之間CD4+T細胞、CD8+T細胞水平不存在顯著差異(P0.05)。7:各組小鼠胰腺HE染色情況在正常對照組胰島的結構完整,形態(tài)良好,未見炎癥細胞浸潤;胰島素治療組胰島結構大量破壞,炎癥細胞浸潤明顯;hUCMSCs治療組胰島的結構相對完整,形態(tài)良好,炎癥細胞較少;白藜蘆醇組胰島的結構有一定損傷,細胞排列略紊亂,周圍有炎癥細胞浸潤;聯合治療組胰島形態(tài)相對較完整,炎癥細胞浸潤較輕;糖尿病對照組完整的胰島結構在鏡下基本找不到,大量炎癥細胞浸潤。結論:應用hUCMSCs聯合白藜蘆醇治療方案可以明顯改善患TIDM的NOD小鼠體重減輕的狀態(tài),改善體內高血糖的狀態(tài),升高小鼠空腹血清C肽水平。通過觀察,我們認為白藜蘆醇可以作為一種輔助藥物,增加hUCMSCs的治療效果,減輕β細胞損傷,維持殘存β細胞功能。
【圖文】：

結 果1.hUCMSCs 分離培養(yǎng)，形態(tài)學觀察從臍帶組織分離出的hUCMSCs在接種3天后可見貼壁生長，光鏡下細胞形態(tài)不一，多數呈梭形，含有部分圓形漂浮細胞，經換液后可去除。接種 8 天后觀察到 hUCMSCs集落增多，形態(tài)較為一致，呈梭形。融合>90%后，消化傳代培養(yǎng)，鏡下可見 hUCMSCs呈形態(tài)均一的長梭形，多次傳代保持穩(wěn)定（圖 1）。2.hUCMSCs 的鑒定P3代 hUCMSCs 經流式細胞儀鑒定細胞表面標記：CD105表達陽性，陽性率 99.3%；CD90 表達陽性，陽性率 96.3%；CD73 表達陽性，陽性率 96.7%；CD34 表達陰性，表達率 0.1%；CD45 表達陰性，表達率 0.1%；CD14 表達陰性，表達率 0.3%；HLA-DR表達陰性，表達率 0.1%（圖 2）。hUCMSCs 高度表達間充質干細胞表面標記，不表達造血干細胞表面標記，符合國際上目前對 MSCs 的定義。

圖 2 hUCMSCs 的流式細胞學鑒定動物的一般情況觀察整個實驗過程中，通過觀察實驗小鼠的飲食、尿量、皮毛、精神狀態(tài)等，確診糖尿病后，均出現飲水量、尿量增多的情況。達到觀察終點時，糖尿鼠毛色相比較其他各組顏色更為晦暗，其中部分（7 只/10 只）出現脫毛情病對照組的小鼠出現反應遲鈍，慵懶的情況。小鼠在實驗過程中體重變化情況每只小鼠發(fā)病當天記作 0d（正常組以適應性飼養(yǎng) 1 周結束后記作 0d），分在第 7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d 體重值（表 4.1，表 4.2，圖 4察我們可以看出在 T1DM 小鼠中，如果不采取治療措施，體重會出現較大速的下降；而在聯合治療組以及白藜蘆醇組小鼠體重在發(fā)病后并未出現過發(fā)病初期維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)；在單純 hUCMSCs 治療組，發(fā)病前期（<顯下降，在 35d 時達到最低值，而后出現體重恢復，，在 49d 時已經恢復到
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 Jun Yao;Cheng Wei;Jian-Yao Wang;Ru Zhang;Ying-Xue Li;Li-Sheng Wang;;Effect of resveratrol on Treg/Th17 signaling and ulcerative colitis treatment in mice[J];World Journal of Gastroenterology;2015年21期

2 Marina Figliuzzi;Barbara Bonandrini;Sara Silvani;Andrea Remuzzi;;WJSC 6~(th) Anniversary Special Issues(2):Mesenchymal stem cells Mesenchymal stem cells help pancreatic islet transplantation to control type 1 diabetes[J];World Journal of Stem Cells;2014年02期

3 ;Reversal of hyperglycemia in diabetic rats by portal vein transplantation of islet-like cells generated from bone marrow mesenchymal stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2007年24期

本文編號：2604422