【摘要】：從防己科千金藤屬山烏龜亞屬(Subgen.Tuberiphania Lo et M.Yang)植物中分離獲得的異喹啉類生物堿(Isoquninoline alkaloids)青風(fēng)藤堿(sinoacutine,sino),前期研究表明青風(fēng)藤堿在小鼠耳廓腫脹、小鼠肉芽腫、大鼠胸膜炎和小鼠碳粒廓清等多種炎癥與免疫抑制模型中均表現(xiàn)出較強的抗炎與免疫抑制活性,但尚待進行細胞分子水平研究,以確認其抗炎作用并探索作用機制,也待在炎性相關(guān)病癥中進行抗炎活性研究。本文采用LPS刺激小鼠巨噬細胞建立體外炎癥反應(yīng)模型,從炎癥因子PGE_2、COX-2、iNOS的表達及炎癥主要通路NF-κB、MAPKs的活化來探討青風(fēng)藤堿在巨噬細胞中發(fā)揮的抗炎作用及其可能的分子機制。并通過建立LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型,檢測青風(fēng)藤堿對模型小鼠肺組織和肺泡灌洗液中細胞因子釋放的影響,以期為青風(fēng)藤堿后續(xù)更深入的研究開發(fā)及其在炎性疾病中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。研究內(nèi)容具體如下:1.青風(fēng)藤堿對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞產(chǎn)生PGE_2的影響半數(shù)抑制率IC_(50)的測定:采用CCK-8試劑法考察青風(fēng)藤堿對RAW264.7細胞的半數(shù)抑制率,經(jīng)統(tǒng)計得到青風(fēng)藤堿IC_(50)=144.487μg/ml。采用1μg/mlLPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥,以青藤堿(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作為陽性對照,青風(fēng)藤堿以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml劑量預(yù)處理2h后與LPS共作用6h,提取細胞培養(yǎng)上清液,用ELISA方法檢測炎癥因子PGE_2,觀察青風(fēng)藤堿對PGE_2的影響。結(jié)果顯示:青風(fēng)藤堿高(100μg/ml)、低劑量(25μg/ml)能極顯著抑制PGE_2的生成(P0.01),中劑量(50μg/ml)能顯著抑制PGE_2的生成(P0.05)。提示青風(fēng)藤堿是通過調(diào)節(jié)巨噬細胞產(chǎn)生PGE_2而發(fā)揮抗炎作用。2.青風(fēng)藤堿對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞活化后COX-2和iNOS表達的影響采用1μg/mlLPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥,以青藤堿(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作為陽性對照,青風(fēng)藤堿以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml劑量預(yù)處理2h后與LPS共作用6h,分別提取細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、提取細胞總蛋白,用實時熒光定量PCR和Western免疫印跡實驗分別檢測青風(fēng)藤堿COX-2、iNOS基因和蛋白表達的影響。結(jié)果顯示:青風(fēng)藤堿高(100μg/ml)、中劑量組(50μg/ml)能顯著促進COX-2 mRNA的表達(P0.05);青風(fēng)藤堿三個劑量組能極顯著降低COX-2蛋白表達水平(P0.01),且具有良好的線性關(guān)系。青風(fēng)藤堿低劑量組對iNOS mRNA有顯著抑制作用(P0.05);青風(fēng)藤堿三個劑量組亦能極顯著降低iNOS蛋白表達水平(P0.01),具有良好的線性關(guān)系。提示青風(fēng)藤堿可能是通過抑制iNOS和COX-2蛋白表達而發(fā)揮抗炎作用。根據(jù)中心法則,DNA、mRNA、蛋白質(zhì)三者間趨勢應(yīng)保持一致,而研究發(fā)現(xiàn)基因與蛋白之間常出現(xiàn)非線性關(guān)系,便說明基因與蛋白結(jié)果會出現(xiàn)差異性,但因為蛋白質(zhì)是最終的表現(xiàn)形式,因此以蛋白結(jié)果為主。3.青風(fēng)藤堿對LPS激活RAW264.7細胞NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響采用1μg/mlLPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥,以青藤堿(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作為陽性對照,青風(fēng)藤堿以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml劑量預(yù)處理2h后與LPS共作用24h,提取細胞總蛋白,用Western免疫印跡實驗分別檢測青風(fēng)藤堿對NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p65和IκB-α蛋白的影響,探討青風(fēng)藤堿在NF-κB信號通路中的作用機制。結(jié)果顯示:青風(fēng)藤堿三個劑量組均能極顯著降低p65磷酸化水平(P0.01),且具有良好的線性關(guān)系。但青風(fēng)藤堿對IκB-α的磷酸化水平無明顯影響。提示青風(fēng)藤堿可能是通過其他途徑而繞過IκB-α蛋白來抑制NF-κB的活化。4.青風(fēng)藤堿對LPS激活RAW264.7細胞MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響采用1μg/mlLPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞炎癥,以青藤堿(100μg/ml)和地塞米松(50μg/ml)作為陽性對照,青風(fēng)藤堿以100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml劑量預(yù)處理2h后與LPS共作用24h,提取細胞總蛋白,用Western免疫印跡實驗分別檢測青風(fēng)藤堿對MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中ERK1/2,JNK和p38信號通路的影響,探討青風(fēng)藤堿在MAPKs信號通路中的作用機制。結(jié)果顯示:青風(fēng)藤堿高劑量組(100μg/ml)對ERK1/2磷酸化水平有降低趨勢但無統(tǒng)計意義,中(50μg/ml)、低劑量組(25μg/ml)能顯著促進ERK1/2磷酸化水平(P0.05)。青風(fēng)藤堿三個劑量組均能極顯著降低JNK磷酸化水平(P0.01),同時具有良好的線性關(guān)系。青風(fēng)藤堿高劑量組(100μg/ml)能顯著抑制p38磷酸化水平(P0.05),而低劑量組(25μg/ml)能顯著促進p38磷酸化水平(P0.05)。提示青風(fēng)藤堿可能對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞存在免疫作用,具體作用機制尚不明確。5.青風(fēng)藤堿對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型的影響采用10mg/kg LPS建立小鼠急性肺損傷模型,12h后小鼠尾靜脈注射給予青藤堿(13mg/kg)、地塞米松(7mg/kg)、青風(fēng)藤堿高劑量(12mg/kg)、中劑量(6mg/kg)、低劑量(3mg/kg)、克班寧(5mg/kg),12h后處死,取肺進行肺系數(shù)計算、組織勻漿,ELISA法檢測勻漿中細胞因子水平及MPO活性,另外進行肺部灌洗并用ELISA法檢測細胞因子水平。結(jié)果顯示:青風(fēng)藤堿高、低劑量組能極顯著減少肺系數(shù),降低肺水腫程度(P0.01)。青風(fēng)藤堿高(12mg/kg)、低劑量組(3mg/kg)能顯著降低組織勻漿中NO的含量(P0.05),中劑量組(6mg/kg)有降低趨勢但無顯著抑制作用。青風(fēng)藤堿三個劑量組均能顯著抑制勻漿中MPO活力(P0.05),抑制中性粒細胞的聚集。青風(fēng)藤堿中(6mg/kg)、低劑量組(3mg/kg)能極顯著降低組織勻漿中TNF-α的含量(P0.01),高劑量組有降低趨勢但無顯著性。青風(fēng)藤堿三個劑量組均能極顯著抑制勻漿中IL-6(P0.01),且具有良好的線性關(guān)系。在肺泡灌洗液細胞因子檢測中,青風(fēng)藤堿中(6mg/kg)、低劑量組(3mg/kg)能顯著降低TNF-α的含量(P0.05);青風(fēng)藤堿三個劑量組均能極顯著抑制IL-6(P0.01)。提示青風(fēng)藤堿是通過抑制NO、MPO、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生來發(fā)揮治療小鼠急性肺損傷的作用。通過上述研究發(fā)現(xiàn),在體外實驗中,青風(fēng)藤堿通過抑制iNOS和COX-2發(fā)揮抗炎作用,同時青風(fēng)藤堿抑制NF-κB和JNK信號通路而達到抗炎效果;在體內(nèi)實驗中,青風(fēng)藤堿抑制LPS誘導(dǎo)的肺部疾病和炎癥從而發(fā)揮抗炎作用,使NO、MPO、TNF-α和IL-6的表達水平下降。以上結(jié)果為青風(fēng)藤堿的研發(fā)提供了一定的實驗數(shù)據(jù)和思路。
【圖文】：

圖 1 花生四烯酸代謝途徑和主要代謝物的活性及藥物作用環(huán)節(jié)igure 1Arachidonic acid metabolic pathway and activity of major metabolites and drug acti急性肺損傷（acute lung injury,ALI）是由于感染、創(chuàng)傷等原因引起肺組織發(fā)生病理性改變的臨床綜合征，表現(xiàn)為肺水腫和肺不張。目前全球因肺損傷的死亡率高達 40%。內(nèi)毒素介導(dǎo)的各種炎癥介質(zhì)和效應(yīng)細胞常引起全身性損其是肺組織，肺是全身靜脈血必經(jīng)的巨型濾器，同時是一個開放的器官，肺各級支氣管、氣管與外界相通，因此肺很容易受到損傷從而引起肺部疾病[1S 主要通過活化肺泡中的巨噬細胞和中性粒細胞，引起促炎因子包括 TNF-6 的過度生成，這些因子又會趨化中性粒細胞等炎癥細胞，引起細胞因子和因子的進一步釋放[11]。一般采用機械通氣的手段來進行治療，，近年來雖有新療策略，包括使用糖皮質(zhì)激素，抗氧化劑，肺表面活性物質(zhì)，血管擴張劑，酶抑制劑，免疫抑制劑等，但是仍然沒有一個可行、有效的治療方法使其降亡率[12]，而炎癥反應(yīng)是致肺組織損傷的首要因素，抑制炎性因子成為主要

因此采用抗炎藥控制炎癥是治療 ALI 的重要措施，但有效的藥物研究仍在探索中。圖2 炎癥中的細胞內(nèi)信號通路Figure 2 Intracellular signaling pathway in inflammation目前用于炎癥治療的藥物主要分為兩大類：甾體抗炎藥（steroiaanti-inflammatory drugs, SAIDs）和非甾體抗炎藥（nonsteroia anti-inflammatorydrugs, NSAIDs）。甾體類抗炎藥主要是類固醇類激素、腎上腺皮質(zhì)激素等，如抗炎活性強的地塞米松[13-16]，對胸膜炎、出血性腦水腫、中耳炎等具有良好的抑制效果。但也存在嚴重不良反應(yīng)，如水鈉潴留，骨質(zhì)疏松，免疫低下，感染等[17-26]。而以阿司匹林為代表的非甾體類抗炎藥具有抗炎、抗風(fēng)濕、止痛等作用，在臨床上常用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多種發(fā)熱以及緩解各種疼痛癥狀，但長期服用也會對胃腸道、腎臟、心血管、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等均造成一系列不良反應(yīng)，如布洛芬、萘普生可致腎病綜合征，長期服用阿司匹林會引起消化不良、胃膜糜爛等，長期或大劑量服用對乙酰氨基酚易導(dǎo)致肝壞死[27]
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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1 韓德承;;青風(fēng)藤功效與常用驗方[J];農(nóng)村百事通;2016年04期

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本文編號：2604381