【摘要】：目的:基于在體單向腸灌流與Caco-2細(xì)胞模型研究四制香附主成分(香附烯酮、α-香附酮)的腸吸收機(jī)制,為四制香附的臨床應(yīng)用及劑型設(shè)計(jì)提供科學(xué)依據(jù)。方法:1.Caco-2細(xì)胞模型的建立與評(píng)價(jià)通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)、測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)的活性、測(cè)量跨膜電阻(TEER)值、熒光素鈉標(biāo)記物滲透量檢測(cè),評(píng)價(jià)Caco-2體外細(xì)胞單層模型是否建立成功。2.四制香附提取物及其主成分的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)通過(guò)MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),計(jì)算不同質(zhì)量濃度四制香附石油醚部位、香附烯酮、α-香附酮及混合物(香附烯酮+α-香附酮)溶液的細(xì)胞存活率,以≥90%的細(xì)胞存活率對(duì)應(yīng)的給藥濃度為安全濃度,確定藥物的安全濃度。3.Caco-2細(xì)胞模型研究四制香附主成分腸吸收機(jī)制采用HPLC-MS/MS測(cè)定轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品中香附烯酮和α-香附酮的含量�？疾鞎r(shí)間、濃度、EDTA、P-gp抑制劑、MRP2抑制劑對(duì)香附烯酮和α-香附酮在Caco-2細(xì)胞模型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,并考察香附烯酮與α-香附酮配伍前后在Caco-2細(xì)胞模型的正向轉(zhuǎn)運(yùn)特性。4.在體單向腸灌流模型研究四制香附主成分腸吸收機(jī)制采用HPLC測(cè)定腸灌流樣品中香附烯酮和α-香附酮的含量。考察不同腸段、濃度、EDTA、P-gp抑制劑對(duì)香附烯酮和α-香附酮腸吸收的影響,并考察四制香附石油醚部位模擬體系和四制香附石油醚部位體系對(duì)香附烯酮、α-香附酮腸吸收的影響。結(jié)果:1.生長(zhǎng)至21天后,細(xì)胞排列緊密,無(wú)縫隙;AP/BL側(cè)堿性磷酸酶活性比約為8,表明細(xì)胞可以產(chǎn)生極化;Caco-2單層細(xì)胞TEER值均大于600Ω·cm~2;標(biāo)示物熒光素鈉的P_(app)值為(2.60±0.17)×10~-77 cm·s~(-1),小于10~-66 cm·s~(-1),表明細(xì)胞完整性良好。2.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,藥物溶液中甲醇含量不得超過(guò)2%;四制香附石油醚部位安全濃度為2.98~46.45μg·mL~(-1);香附烯酮安全濃度為3~90μg·mL~(-1);α-香附酮安全濃度為3~120μg·mL~(-1);香附烯酮與α-香附酮以1:2、1:3的比例配伍(各比例中α-香附酮濃度保持30μg·mL~(-1)不變)給藥4 h后,細(xì)胞的存活率均大于90%。3.香附烯酮、α-香附酮的轉(zhuǎn)運(yùn)量具有濃度和時(shí)間依賴性,其P_(app)值均大于1×10~-66 cm·s~(-1),外排率均在0.5~1.5;加入EDTA、維拉帕米、MK-571后,香附烯酮和α-香附酮的P_(app)和ER值沒(méi)有明顯改變;配伍后,香附烯酮和α-香附酮AP-BL側(cè)的P_(app)值均顯著增加。4.香附烯酮與α-香附酮在整個(gè)腸段均易吸收,其中香附烯酮在回腸吸收最好,α-香附酮在空腸吸收最好;在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),香附烯酮、α-香附酮的吸收參數(shù)K_a和P_(eff)值無(wú)顯著性差異,其P_(eff)值均大于1.2×10~(-3)/cm·min~(-1);維拉帕米及EDTA的存在并沒(méi)有明顯改善香附烯酮與α-香附酮腸吸收;與單體比較,四制香附石油醚模擬體系和四制香附石油醚部位體系中的α-香附酮和香附烯酮吸收參數(shù)K_a和P_(eff)值均有顯著性差異。結(jié)論:本課題通過(guò)兩種腸吸收模型研究發(fā)現(xiàn),香附烯酮與α-香附酮的腸吸收機(jī)制以被動(dòng)擴(kuò)散為主,不經(jīng)細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn),不受P-gp的影響。Caco-2細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn),香附烯酮與α-香附酮跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)不受MRP2的影響,且香附烯酮與α-香附酮之間可能存在協(xié)同作用。在體單向腸灌流模型研究發(fā)現(xiàn),香附烯酮與α-香附酮的腸吸收存在協(xié)同作用,四制香附石油醚部位中其他成分與香附烯酮、α-香附酮成分的腸吸收可能存在協(xié)同作用。
【圖文】：

圖 1-1 Caco-2 細(xì)胞單層示意圖Fig.1-1 Caco-2 cell monolayer mode2.2 Caco-2 細(xì)胞模型的評(píng)價(jià)2.2.1 Caco-2 細(xì)胞形態(tài)[17]細(xì)胞按 2×105/mL 密度接種于 12 孔板中，用培養(yǎng)液培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng) 21 天后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并進(jìn)行拍照。2.2.2 堿性磷酸酶的活性測(cè)定[18]采用堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞兩側(cè)堿性磷酸酶的活性，其作用機(jī)制是堿性磷酸酶可以把磷酸苯二鈉分解，分解后的產(chǎn)物是游離酚和磷酸，游離酚在堿性條件下與4-氨基安替吡啉反應(yīng)后，經(jīng)鐵氰化鉀氧化成紅色醌衍生物。因此，可以用紅色深淺來(lái)判斷堿性磷酸酶活力的高低。Caco-2 細(xì)胞在 12 孔板中生長(zhǎng)至 5，13，21 天，用 HBSS 緩沖液（pH=7.4

圖 1-3 Caco-2 細(xì)胞形態(tài)圖ptical microscope photo of Caco-2 cells cultiv的活性間的細(xì)胞單層的堿性磷酸酶的活性結(jié)果見(jiàn)表 活力比 (AP/BL) 隨時(shí)間的增加而增長(zhǎng)，到第明堿性磷酸酶的分布非常不對(duì)稱，，出現(xiàn)了明生長(zhǎng)階段 Caco-2 細(xì)胞單層堿性磷酸酶活力ctivity of Caco-2 cells monolayer at different growt時(shí)間（t/d） 堿性磷酸酶活力5 1.249±0.013 3.602±0.2
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R283.6;R285

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本文編號(hào)：2604214