【摘要】：肝纖維化是多種非自限性的慢性肝臟疾病向肝硬化進(jìn)展的中間病理過程,是威脅人類健康的常見疾病,也是原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一。世界現(xiàn)代肝病學(xué)者奠基人、美國(guó)肝病鼻祖Hans Popper教授指出“誰能阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生,誰將治愈大多數(shù)慢性肝病”。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),肝纖維化是可以預(yù)防、干預(yù)、甚至逆轉(zhuǎn)的。然而,迄今為止國(guó)際上尚未出現(xiàn)安全有效、肝臟特異性靶向以及耐受性較好的化學(xué)藥物被美國(guó)FDA(Food and Drug Administration)批準(zhǔn)用于人類肝纖維化的治療。在我國(guó),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(China Food and Drug Administration,CFDA)批準(zhǔn)以肝纖維化為適應(yīng)證的中藥主要有扶正化瘀膠囊(片)和復(fù)方鱉甲軟肝片。六味五靈片(Liuweiwuling tablets,LWWL)是治療慢性乙型肝炎氨基轉(zhuǎn)移酶升高的國(guó)家六類新藥,具有保肝降酶持久、反跳慢的優(yōu)勢(shì)。臨床研究發(fā)現(xiàn)LWWL聯(lián)合核苷(酸)類藥物用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化療效顯著,因此本研究全面檢索其臨床隨機(jī)對(duì)照研究(randomized controlled study,RCT)并進(jìn)行Meta分析。在揭示LWWL對(duì)慢性乙型肝炎相關(guān)肝纖維化具有潛在的治療作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步客觀評(píng)價(jià)LWWL抗肝纖維化藥效學(xué)作用。采用膽管結(jié)扎(bile duct ligation,BDL)、四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化模型,從保肝、抑制膠原纖維生成、抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化、增殖及趨化、減少細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的生成、促進(jìn)ECM降解等方面評(píng)價(jià)了LWWL抗肝纖維化的量效關(guān)系,并初步探討其潛在的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)與藥效與負(fù)調(diào)控TGF-β/Smad和NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的膠原合成和免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究從臨床研究啟發(fā)基礎(chǔ)研究再回歸臨床的研究思路,以期為L(zhǎng)WWL二次開發(fā)擴(kuò)大臨床適應(yīng)癥提供參考依據(jù),同時(shí)為臨床肝纖維化的治療提供一些新的方法和思路。本課題的具體研究?jī)?nèi)容如下:第一部分六味五靈片聯(lián)合核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎肝纖維化的系統(tǒng)評(píng)價(jià)目的:系統(tǒng)評(píng)價(jià)LWWL聯(lián)合核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎肝纖維化有效性及安全性。方法:計(jì)算機(jī)檢索Pubmed、Embase、Cochrane Library(2015年第9期)、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(CBM)、相關(guān)期刊論文(CNKI)、中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫(VIP)、萬方數(shù)據(jù)在線知識(shí)服務(wù)平臺(tái),全面收集有關(guān)LWWL聯(lián)合核苷(酸)類藥物治療慢性乙型肝炎肝纖維化的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(randomized controlled trial,RCT),檢索時(shí)限均從建庫至2015年10月29日。由2位評(píng)價(jià)員按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料和評(píng)價(jià)納入研究的方法學(xué)質(zhì)量后,采用Rev Man5.3軟件進(jìn)行meta分析。結(jié)果:最終納入7個(gè)RCTs,共1021例慢性乙型肝炎肝纖維化患者,其中治療組529例,對(duì)照組492例。分析結(jié)果顯示:與單用核苷(酸)類藥物相比,LWWL聯(lián)合核苷(酸)類藥物不僅可降低慢性乙型肝炎肝纖維化患者血清肝纖維化指標(biāo)HA[SMD=-1.26,95%CI(-1.92,-0.59),P=0.0002]、LN[SMD=-1.55,95%CI(-2.27,-0.83),P0.0001]、PC-Ⅲ[SMD=-1.39,95%CI(-2.21,-0.58),P=0.0008]、Ⅳ-C[SMD=-1.49,95%CI(-2.25,-0.72),P=0.0001];還可以改善肝功能生化指標(biāo):ALT[SMD=-1.17,95%CI(-1.41,-0.94),P0.00001]、AST[SMD=-1.25,95%CI(-1.54,-0.96),P0.00001]、TBIL[SMD=-0.87,95%CI(-1.21,-0.53),P0.00001];提高臨床總有效率[OR=4.59,95%CI(2.05,10.25),P=0.0002];但并不能提高HBV DNA轉(zhuǎn)陰率[OR=1.51,95%CI(0.96,2.39),P=0.08];此外,無明顯不良反應(yīng)報(bào)道。結(jié)論:LWWL聯(lián)合核苷(酸)類藥物可明顯改善患者肝功能,抑制肝纖維化,提高臨床總有效率,且不良反應(yīng)少、耐受性較好;在臨床上LWWL可能具有潛在的抑制肝纖維化的作用。第二部分六味五靈片抗膽管結(jié)扎和四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的藥效評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究目的:研究LWWL抗BDL和CCl4誘導(dǎo)的模型大鼠肝纖維化的藥理作用,并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。方法:(1)采用BDL誘導(dǎo)的膽汁淤積型大鼠肝纖維化模型。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Control),BDL模型組,秋水仙堿組(BDL+Colchicine 0.0002g/kg),LWWL低、中、高劑量組(BDL+LWWL 0.4 g/kg,1.6 g/kg,6.4 g/kg)。除假手術(shù)組開腹后剝離膽總管后縫合,其余各組均開腹剝離膽總管雙重結(jié)扎后縫合,術(shù)后第四天開始分別給藥至第21天處死,取血取肝。采用HE染色法和天狼星紅染色法(sirius red staining)觀察肝組織病理學(xué)變化;比色法檢測(cè)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST),堿水解法檢測(cè)肝組織羥脯胺酸(hydroxyproline,Hy P);免疫組化法檢測(cè)肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、I型膠原(collagen type I,Collagen type I)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)p65表達(dá);ELISA法檢測(cè)血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factorβ1,TGF-β1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)的水平;實(shí)時(shí)定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)肝組織中α-SMA(Acta2)、Collagen I、TGF-β1、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP2)、Smad3、TNF-α、白介素-6(interleukin 6,IL-6)和白介素-1β(IL-1β)m RNA的表達(dá);Western blot免疫印跡法檢測(cè)肝組織α-SMA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白和激活素膜結(jié)合抑制劑(bone morphogenic protein and activin membrane-bound inhibitor,Bambi)、Smad3、Smad2/3、Smad7、p-Smad3、IκBα、p-IκBα及NF-κB p65蛋白的表達(dá)。(2)采用CCl4誘導(dǎo)化學(xué)性損傷的大鼠肝纖維化模型。SD大鼠隨機(jī)分為橄欖油溶劑對(duì)照組,CCl4模型組,秋水仙堿組(CCl4+Colchicine 0.0002g/kg),LWWL低、中、高劑量組(CCl4+LWWL 0.4 g/kg,1.6 g/kg,6.4 g/kg),以CCl4和橄欖油1:1腹腔注射2 m L/kg造模,每周2次,造模8周后開始給予藥物治療,第12周處死,取血取肝。藥效學(xué)指標(biāo)檢測(cè)同上。結(jié)果:(1)LWWL可有效地改善大鼠肝功能,抑制大鼠肝組織膠原纖維的生成。主要表現(xiàn)為L(zhǎng)WWL可劑量依賴性地減少大鼠肝組織小膽管增生,減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維間隔的產(chǎn)生,明顯保護(hù)肝細(xì)胞損傷,降低肝組織Hy P含量,此外還可改善BDL導(dǎo)致的大鼠肝臟重量的增加。(2)LWWL可抑制HSC的激活、增殖及趨化。主要表現(xiàn)為L(zhǎng)WWL可顯著地減少HSC活化表型α-SMA、Collagen I的表達(dá),同時(shí)抑制促進(jìn)HSC增殖和趨化的促纖維化生長(zhǎng)因子PDGF和VEGF的表達(dá)。(3)LWWL通過調(diào)節(jié)MMPs及其特異性地抑制劑TIMPs,抑制病理性基質(zhì)降解,加速異常增生的ECM的降解。主要表現(xiàn)為L(zhǎng)WWL上調(diào)促進(jìn)ECM降解的MMP13的表達(dá),下調(diào)與ECM生成呈正相關(guān)的MMP2、TIMP1、TIMP2的表達(dá)。(4)LWWL可抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。主要表現(xiàn)為L(zhǎng)WWL可下調(diào)TGF-β1、Smad3、Smad2/3及p-Smad3的蛋白表達(dá),上調(diào)Bambi、Smad7的蛋白表達(dá)。(5)LWWL可抑制NF-κB信號(hào)通路的基因轉(zhuǎn)錄。主要表現(xiàn)為L(zhǎng)WWL可減少IκB-α蛋白磷酸化,使其降解減少,還可劑量依賴性地減少NF-κB p65的核轉(zhuǎn)錄,同時(shí)使NF-κB p65蛋白表達(dá)降低。此外,LWWL可劑量依賴性地降低NF-κB調(diào)控的炎癥因子TFN-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)。結(jié)論:LWWL能夠有效地阻斷和抑制BDL和CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的進(jìn)展,其作用機(jī)制可能通過負(fù)調(diào)控TGF-β/Smad和NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活,從而減輕肝臟炎癥反應(yīng),抑制HSC的激活、增殖及持續(xù)活化,促進(jìn)ECM的降解,最終延緩、阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展。以期為L(zhǎng)WWL二次開發(fā)擴(kuò)大其治療肝纖維化的臨床適應(yīng)癥提供了參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 羅宏麗;肖順林;余欣;;抑毒調(diào)肝合劑抗大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制研究[J];中國(guó)藥房;2017年04期

2 彭福江;張?zhí)鞎?袁美蓉;;復(fù)方甘草酸苷對(duì)慢性乙型肝炎患者肝功能、肝纖維化指標(biāo)及炎癥因子的影響[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2017年04期

3 王偉杰;季書;尚立芝;潘曉麗;王琦;王付;;柴胡疏肝散對(duì)大鼠肝纖維化標(biāo)志物、超聲監(jiān)測(cè)指標(biāo)及病理變化的影響[J];中藥藥理與臨床;2016年05期

4 賈玉杰;趙芳;張彩華;姜妙娜;孔露;李東寧;李驄;;中藥肝復(fù)康對(duì)TNF-α介導(dǎo)的炎癥性肝損傷和大鼠肝纖維化的抑制作用[J];中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志;2016年02期

5 劉海軍;;六味五靈片聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎肝纖維化的臨床效果[J];臨床合理用藥雜志;2015年24期

6 尚立芝;王付;王琦;苗小玲;甘陳菲;張慧娜;王幫眾;;柴胡疏肝散對(duì)肝纖維化大鼠TGF-β_1/Smad信號(hào)通路的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2015年12期

7 宋建華;汪明明;;恩替卡韋聯(lián)合六味五靈片治療代償期乙型肝炎肝硬化臨床研究[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2015年02期

8 劉曉亞;劉瑞霞;崔立建;侯斐;文艷;陰峧宏;;膽管結(jié)扎和四氯化碳誘導(dǎo)Wistar大鼠肝纖維化模型的建立及相關(guān)指標(biāo)的對(duì)比分析[J];臨床肝膽病雜志;2015年02期

9 何兵;;恩替卡韋聯(lián)合六味五靈片治療慢性乙型肝炎肝硬化的近期療效及安全性研究[J];中國(guó)醫(yī)刊;2015年02期

10 周立文;葛偉偉;張雅麗;胡義揚(yáng);;復(fù)方鱉甲軟肝方血清防治肝纖維化作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)生化藥物雜志;2015年01期

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本文編號(hào)：2604129