【摘要】：目的:以NLRP3炎癥小體通路為切入點(diǎn),以炎性細(xì)胞/組織-炎性細(xì)胞因子-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為主線,評(píng)價(jià)桂枝抗炎有效部位對(duì)內(nèi)毒素中毒小鼠的保護(hù)作用及抗炎效應(yīng)的分子機(jī)制。方法:采用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,評(píng)價(jià)桂枝揮發(fā)油和桂皮醛抗炎效應(yīng)的NLRP3炎癥小體通路分子機(jī)制。以THP-1巨噬樣細(xì)胞為載體,采用不同的NLRP3炎癥小體激活物造模,觀察桂枝揮發(fā)油和桂皮醛對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響。ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清中ASC、Caspase-1(p20)、pro-IL-1β和IL-1β的含量,Western Blotting法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC、ProCaspase-1和Pro-IL-1β蛋白表達(dá),免疫熒光法測(cè)定Cathepsin B、NLRP3和ASC蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá),熒光顯微鏡法測(cè)定細(xì)胞ROS含量。構(gòu)建內(nèi)毒素中毒C57BL/6J小鼠模型,觀察桂枝揮發(fā)油及桂皮醛對(duì)小鼠一般狀態(tài)和體重的影響,全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定全血WBC和PLT的計(jì)數(shù),測(cè)定小鼠臟器指數(shù),ELISA法和液相蛋白芯片技術(shù)測(cè)定血清中前炎癥因子(IL-1β、IL-18、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ)和趨化因子(MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、M-CSF、GM-CSF和G-CSF)的含量,進(jìn)行肺組織的病理組織學(xué)觀察,Griess法測(cè)定肺組織NO含量,RT-PCR法測(cè)定肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、iNOS、p65、IFN-α、IFN-β和STAT1 mRNA的表達(dá),Western Blotting法測(cè)定肺組織中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1,Caspase-1(p20)、Caspase-12、IL-1β、COP-1和POP-1蛋白表達(dá),免疫組化法檢測(cè)肺組織中P2X7R和Cathepsin B蛋白的表達(dá)。構(gòu)建內(nèi)毒素中毒KM種小鼠模型,評(píng)價(jià)桂枝乙酸乙酯部位及其主要成分桂皮酸對(duì)內(nèi)毒素中毒小鼠的抗炎保護(hù)作用及機(jī)制。測(cè)定小鼠臟器指數(shù)和肺臟相對(duì)含水量,測(cè)定血清中BUN、CRE、ALT、AST及肝組織中SOD、MDA的水平,ELISA法測(cè)定血清IL-1β、IL-18、TNF-α和IFN-γ的含量,進(jìn)行肺臟、脾臟、肝臟和腎臟的病理組織學(xué)觀察,RT-PCR法測(cè)定肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達(dá),Western Blotting法測(cè)定肺組織中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1(p20)和Pro-IL-1β蛋白的表達(dá)。結(jié)果:以ATP和nigericin為NLRP3炎癥小體激活物時(shí),桂枝揮發(fā)油和桂皮醛能下調(diào)THP-1巨噬樣細(xì)胞Pro-Caspase-1、p20、Pro-IL-1β和IL-1β蛋白及NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達(dá)。其中桂枝揮發(fā)油能顯著降低細(xì)胞上清和裂解液中Pro-IL-1β蛋白表達(dá)(P0.05),抑制細(xì)胞裂解液中NLRP3和IL-1βmRNA的表達(dá)(P0.05)。桂皮醛能顯著降低THP-1巨噬樣細(xì)胞上清中Caspase-1(p20)水平(P0.05),抑制細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC和IL-1βmRNA的表達(dá)(P0.05)。此外,桂枝揮發(fā)油和桂皮醛能降低細(xì)胞NLRP3和ASC蛋白的相對(duì)共定位面積、細(xì)胞ROS及Cathepsin B蛋白的表達(dá)(P0.05)。給予桂枝揮發(fā)油和桂皮醛后,能改善內(nèi)毒素中毒C57BL/6J小鼠的精神狀態(tài)和活動(dòng)情況。抑制血清中IL-1β、IL-18、IL-5、IFN-γ、MIP-1β和M-CSF的表達(dá),減少肺組織中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量和NO含量,下調(diào)肺組織中NLRP3、p20、Pro-IL-1β和P2X7R蛋白表達(dá),下調(diào)肺中NLRP3、IL-1β、iNOS、IFN-βmRNA表達(dá)(P0.05)。此外,桂枝揮發(fā)油還能減少血清MCP-1的分泌和肺中STAT1 mRNA表達(dá),桂皮醛能下調(diào)肺中Cathepsin B蛋白表達(dá)及升高COP-1蛋白水平(P0.05)。桂枝乙酸乙酯部位和桂皮酸能增加內(nèi)毒素中毒小鼠的胸腺指數(shù),減少模型小鼠血清中BUN、IL-18和TNF-α的含量,下調(diào)肺中NLRP3和p20蛋白及NLRP3、Caspase-1和IL-1βmRNA的表達(dá),并對(duì)脾和肺臟損傷有改善作用,對(duì)抗脾臟中淋巴細(xì)胞凋亡及減少肺中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量。此外,桂枝乙酸乙酯部位能顯著減少血清中CRE和肝臟中MDA含量,增加肝臟SOD活力和血清IFN-γ含量,顯著下調(diào)Pro-IL-1β蛋白的表達(dá)。桂皮酸還能顯著降低肺含水量和血清IL-1β水平(P0.05)。結(jié)論:桂枝揮發(fā)油、乙酸乙酯部位及桂皮醛、桂皮酸均可通過(guò)它們的抗炎活性,發(fā)揮對(duì)內(nèi)毒素中毒小鼠的保護(hù)作用�？寡讬C(jī)制與抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路激活相關(guān)。研究結(jié)果可為解表藥桂枝治療“表證”的臨床運(yùn)用提供了更為扎實(shí)的科學(xué)依據(jù),并豐富了辛味解表藥桂枝“辛散解表”性效理論的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。
【圖文】：

桂枝揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

成都中醫(yī)藥大學(xué) 2017屆博士研究生學(xué)位論文.2 THP-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞活力采用 MTS 法測(cè)定 THP-1 細(xì)胞在 72 h 內(nèi)的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，THP-1 細(xì)胞在~6 h 的生長(zhǎng)存在一個(gè)停滯期，在 6 h~72 h 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，表明可取培2 h 的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖 1-2）。此外，，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)現(xiàn)所使用 THP-1細(xì)胞的活細(xì)胞率達(dá) 98%。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2603757