【摘要】：目的:研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激在高脂飲食聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)大鼠腎臟損傷中的作用,及研究黃芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)對其的影響。方法:通過高脂飲食飼養(yǎng)SD大鼠6周后,聯(lián)合一次性腹腔注射(intraperitoneal injection,ip)低劑量STZ(35 mg/kg)制作DN大鼠模型。造模成功(血糖≥16.7 mmol/L)后,隨機(jī)分為DN模型(Model)組,AS-Ⅳ(20,40,80 mg/kg)及二甲雙胍(Metformin,200 mg/kg)治療組,另設(shè)正常對照(Control)組,每組8只。以造模成功作為實驗的起始,記為0周,連續(xù)給藥8周。實驗過程中觀察各組大鼠一般狀況,定期測定各組大鼠體重,血糖(blood glucose,BG)水平。實驗結(jié)束時,代謝籠收集24h尿液,用于測定24h尿蛋白,尿微量白蛋白,尿肌酐(urine creatinnie,UCr)的含量;腹主動脈取血,用于測定血肌酐(serum creatinine,SCr),尿素氮(blood urea nitrogen,BUN),甘油三酯(triglyeride,TG),總膽固醇(total cholesterol,TC)的含量。收集腎臟,稱量其重量用于計算腎臟臟器指數(shù);HE,PASM,Masson染色觀察各組大鼠腎小管組織形態(tài)學(xué)變化;TUNEL染色及透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況;免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)法檢測各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞GRP 78陽性細(xì)胞的表達(dá)情況;蛋白免疫印記(western blot,WB)法分別檢測各組大鼠腎組織中Bax,Bcl-2,Cleaved caspase-3,p-PERK,ATF4,CHOP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.與正常組的大鼠相比,DN組的大鼠一般狀況較差,出現(xiàn)精神萎靡倦怠,毛豎暗淡,身體消瘦,進(jìn)食、進(jìn)水,尿量明顯增加;在經(jīng)AS-Ⅳ治療約3周后,大鼠一般狀況便開始好轉(zhuǎn),“三多一少”的癥狀減輕。2.與正常組的大鼠相比,DN組的大鼠體重顯著下降,而血糖水平顯著升高(p0.001);與DN組相比,AS-Ⅳ治療組,體重得到改善,但差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);血糖水平,在AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療6-8 W時,大鼠的血糖水平得到明顯的改善,且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01 or p0.05)。3.與正常組的大鼠相比,DN組的大鼠腎功能與代謝指標(biāo),腎重指數(shù),尿微量白蛋白,尿總蛋白與尿肌酐之比值,SCr,BUN,TG,TC水平明顯升高(p0.001);與DN組的大鼠比較,AS-Ⅳ(20,40,80 mg/kg)治療組的大鼠,腎重指數(shù)得到改善,但差異并不具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但其它腎功能與代謝指標(biāo)得到明顯改善(p0.001 or p0.01 or p0.05)。4.HE染色顯示,DN組的大鼠近端腎小管出現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變,如上皮細(xì)胞水腫、肥大、腎小管空泡病變、腎小管擴(kuò)張、形態(tài)不規(guī)則、上皮細(xì)胞脫落等;AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療大鼠,腎小管病理變化得到明顯改善,上皮細(xì)胞水腫、腎小管空泡病變減輕,上皮細(xì)胞脫落減少。PASM染色顯示,DN大鼠近端腎小管基底膜染色明顯增粗(黑色),表明基底膜增厚,與正常組比較,DN組PASM染色陽性評分明顯增加(p0.001);AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠腎小管基底膜增厚減輕,與DN組比較,PASM染色陽性評分明顯降低(p0.001 or p0.01)。Masson染色顯示,DN大鼠近端腎小管基底膜及間質(zhì),藍(lán)色區(qū)域明顯增多,表明腎小管基底膜及間質(zhì)具有較多的膠原沉積,與正常組比較,DN組Masson染色陽性評分明顯增加(p0.001);AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠腎小管基底膜及間質(zhì)膠原沉積減少,與DN組比較,Masson染色陽性評分明顯降低(p0.001 or p0.01)。5.TUNEL染色顯示,細(xì)胞核呈棕黃色的陽性細(xì)胞主要定位于近端腎小管內(nèi),與正常組相比,DN組的大鼠近端腎小管內(nèi)可見大量凋亡細(xì)胞(p0.001);與DN組相比,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠,腎小管內(nèi)凋亡細(xì)胞明顯減少(p0.001 or p0.01)。6.透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,與正常組相比,DN組的大鼠腎小管上皮細(xì)胞核表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮,核體積縮小,核膜收縮等凋亡形態(tài)結(jié)構(gòu)特征;與模型組相比,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠,腎小管上皮細(xì)胞核染色質(zhì)、核膜等形態(tài)結(jié)構(gòu)得到顯著改善。7.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與正常組比較,DN組的大鼠近端腎小管GRP 78蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)水平明顯增加(p0.01);與DN組比較,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠腎小管GRP 78蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)水平顯著減少(p0.01 or p0.05)。8.WB結(jié)果顯示,與正常組比較,DN組的大鼠腎組織凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax/Bcl-2,Cleaved caspase-3蛋白及ER應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)p-PERK/PERK,ATF4,CHOP蛋白的表達(dá)明顯增加(p0.01);與DN組比較,AS-Ⅳ(40,80 mg/kg)治療組的大鼠腎組織上述蛋白的表達(dá)顯著減少(p0.01 or p0.05)。結(jié)論:1.高脂飲食6周聯(lián)合STZ 35 mg/kg成功制作糖尿病腎病大鼠模型。2.黃芪甲苷能夠改善DN大鼠代謝指標(biāo)及腎臟病理生理功能。3.黃芪甲苷能夠減少凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax/Bcl-2,Cleaved caspase-3蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP 78,p-PERK/PERK,ATF4,CHOP的表達(dá)。4.黃芪甲苷可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。
【圖文】：

藥黃芪提取物中的主要活性成分，，一種皂苷類單分子量：784.97，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖 1。許多研究已以及抗凋亡等多種藥理作用[28-29]。據(jù)報道，AS改變，延緩 DN 的發(fā)展，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用實，AS-Ⅳ 對體外高糖培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用[32-34]。 對 2 型 DN 腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用依高脂飲食聯(lián)合小劑量 STZ 誘導(dǎo) 2 型 DN 大鼠模的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，以此為 AS方法。

N 組、AS-Ⅳ (20、40、80 mg/kg)組、二甲雙胍組的大鼠在 STZ 注射 1況較差，表現(xiàn)為精神萎靡倦怠，毛豎暗淡，動作遲緩，弓背蜷臥，食、進(jìn)水量，尿量明顯增加；經(jīng) AS-Ⅳ 和二甲雙胍治療約 3 周后，開始好轉(zhuǎn)，“三多一少”癥狀也有所緩解。芪甲苷對實驗動物體重和血糖的影響黃芪甲苷對實驗動物體重的影響驗期間，于實驗動物 STZ 注射后，每周同一時間定期，對各組大鼠后，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。如圖 2 所示，與正常組的大鼠相比，STZ 糖大鼠體重減輕(p < 0.05)，且整個實驗過程中，均低于正常組的大鼠(40，80 mg/kg)及二甲雙胍治療組的大鼠，與模型組的大鼠相比，體重復(fù)至造模前的水平，且差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(p > 0.05)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2603725