【摘要】：多胺可促進(jìn)胃腸黏膜損傷修復(fù),還可調(diào)控緊密連接及粘附連接的形成和穩(wěn)定而保護(hù)黏膜屏障功能。胃腸黏膜損傷是脾虛證常見的病理改變,四君子湯是益氣健脾的代表方,臨床常用于改善胃腸病患者脾氣虛證。課題組前期研究表明,四君子湯水提物及黨參、黃芪、甘草、白術(shù)的多糖提取物對應(yīng)激性潰瘍大鼠胃黏膜損傷有防治作用,機制與其提高胃或小腸黏膜多胺含量有關(guān);對胃腸黏膜損傷修復(fù)環(huán)節(jié)——上皮細(xì)胞遷移的研究發(fā)現(xiàn),黨參、白術(shù)、黃芪、甘草、四君子湯的提取物(多糖、黃酮等)能促進(jìn)小腸上皮IEC-6細(xì)胞遷移,作用與其影響多胺信號通路有關(guān),Ca~(2+)調(diào)節(jié)是關(guān)鍵指標(biāo);白術(shù)多糖能提高IEC-6細(xì)胞粘附連接蛋白E-cadherin、β-catenin、α-catenin表達(dá);但尚待在整體動物水平從細(xì)胞連接方面探討益氣健脾中藥胃腸黏膜損傷修復(fù)作用機制。研究目的觀察四君子湯(水提物和多糖)對吲哚美辛造模大鼠胃和小腸黏膜損傷的影響,并從多胺調(diào)節(jié)黏膜屏障和細(xì)胞連接蛋白的角度,探討益氣健脾代表方四君子湯防治胃腸黏膜損傷的作用機制。研究方法1、四君子湯水提物和多糖的提取分離:四君子湯藥材(人參、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草各等份)經(jīng)水煎煮得四君子湯水提物,HPLC法進(jìn)行成分分析;四君子湯經(jīng)水提醇沉法、sevag法去蛋白,分別得“四君子湯多糖1”、“四君子湯多糖2”并以苯酚硫酸法檢測糖含量,HPLC法檢測“四君子湯多糖2”純度。2、吲哚美辛致大鼠胃腸黏膜損傷模型的復(fù)制:大鼠皮下注射吲哚美辛(10mg/kg、40mg/kg)造模,7h后處死,篩選胃黏膜損傷造模的合適劑量;大鼠皮下注射吲哚美辛(4mg/kg、8mg/kg)造模,3d或7d后處死,篩選小腸黏膜損傷造模的合適劑量;以吲哚美辛6mg/kg+四君子湯水提物10g/kg,給藥3d或7d,篩選四君子湯防治小腸黏膜損傷合適的給藥時間。3、四君子湯防治大鼠胃和小腸黏膜損傷實驗:(1)胃黏膜損傷實驗:灌胃四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)1h后,吲哚美辛40mg/kg皮下注射造模,7h后處死動物,取材胃黏膜及血漿,記錄各組胃黏膜損傷大體評分,HE染色進(jìn)行病理評分;(2)小腸黏膜損傷實驗:吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,造模共6d,每天再灌胃四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)或四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg,與水提物生藥量相當(dāng))共6d為給藥方法,第7天處死動物,取材小腸黏膜及血漿,記錄小腸黏膜損傷大體評分,HE染色進(jìn)行病理評分。4、柱前衍生HPLC法檢測胃、小腸黏膜多胺含量。5、試劑盒檢測血漿D-乳酸濃度。6、ELISA法檢測胃、小腸黏膜Ca~(2+)含量。7、Western blot和免疫組化法檢測胃黏膜緊密連接蛋白(Occludin、ZO-1、Claudin-3)和粘附連接蛋白(E-cadherin、α-catenin、β-catenin)表達(dá);免疫組化法檢測小腸黏膜緊密連接蛋白(ZO-1、Occludin、Claudin-3)和粘附連接蛋白(α-catenin、E-cadherin、β-catenin)表達(dá)。研究結(jié)果1、四君子湯提取物的純化及分析:四君子湯水提物得率35.42%,為本研究受試藥之一;高效液相色譜法可檢測到甘草苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和白術(shù)內(nèi)酯III等成分;四君子湯多糖1、多糖2得率分別為8.77%、7.16%,多糖含量分別為92.34%、81.59%;根據(jù)前期實驗結(jié)果,多糖2藥效較優(yōu),選為本研究受試藥之一,高效液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)“四君子湯多糖2”分子量較集中,是純度較高的多糖,但存在其它較小的吸收峰,并非均一性多糖。2、吲哚美辛致大鼠胃和小腸黏膜損傷造模實驗方案:(1)胃黏膜損傷模型:吲哚美辛(40mg/kg)皮下注射7h后,可造成大鼠胃黏膜損傷;吲哚美辛40mg/kg選為胃黏膜損傷造模劑量。(2)小腸黏膜損傷模型:吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d,可造成大鼠小腸黏膜損傷;造模同時以四君子湯水提物(10g/kg)灌胃給藥對小腸黏膜損傷有防治作用;吲哚美辛6mg/kg/d皮下注射,共6d(第7天處死),選為大鼠小腸黏膜損傷造模條件。3、四君子湯對吲哚美辛致大鼠胃和小腸黏膜損傷的影響:(1)四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)對造模大鼠胃黏膜損傷有防治作用;(2)四君子湯水提物(15g/kg)和多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)對造模大鼠小腸黏膜損傷有防治作用,大體和病理評分與模型組比較P0.05或P0.01,同等生藥量下四君子湯多糖藥效優(yōu)于水提物。4、四君子湯對造模大鼠胃和小腸黏膜多胺含量的影響:(1)四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)可提高造模大鼠胃黏膜多胺(精脒)含量;(2)四君子湯水提物(15g/kg)、四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)可提高造模大鼠小腸黏膜多胺(精脒)含量;提示四君子湯防治胃腸黏膜損傷作用可能與其提高多胺含量有關(guān)。5、四君子湯對造模大鼠腸通透性指標(biāo)(血漿D-乳酸)的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿D-乳酸明顯升高(與正常組比較P0.01),提示吲哚美辛造模可引起腸通透性增高,而四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)給藥8h后,對造模大鼠血漿D-乳酸升高無明顯影響。(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠血漿D-乳酸明顯升高(與正常組比較P0.01);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)給藥6d,可降低小腸黏膜損傷大鼠血漿D-乳酸(與模型組比較P0.05或P0.01),提示四君子湯可改善小腸黏膜損傷所致的腸通透性增高。6、四君子湯對造模大鼠胃和小腸黏膜Ca~(2+)含量的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠胃黏膜Ca~(2+)含量降低(與正常組比較P0.05),提示胃黏膜損傷可引起Ca~(2+)含量降低;四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)給藥8h后胃黏膜Ca~(2+)含量略高于模型組(P0.05)。(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠小腸黏膜Ca~(2+)含量略低于正常組(P0.05);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(1.074g/kg)能提高小腸黏膜Ca~(2+)含量(與模型組比較P0.05);提示四君子湯一定程度上可提高造模大鼠小腸黏膜Ca~(2+)含量。7、四君子湯對造模大鼠胃和小腸黏膜緊密連接和粘附連接蛋白表達(dá)的影響:(1)吲哚美辛致胃黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),四君子湯水提物(5g/kg、15g/kg)能提高造模大鼠胃黏膜緊密連接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附連接E-Cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)(與模型組比較P0.05或P0.01),但對β-catenin表達(dá)無明顯影響;(2)吲哚美辛致小腸黏膜損傷實驗發(fā)現(xiàn),四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(0.358g/kg、1.074g/kg)能提高造模大鼠小腸黏膜緊密連接ZO-1、Occludin、Claudin-3和粘附連接E-cadherin、α-catenin蛋白表達(dá)(與模型組比較P0.05或P0.01);四君子湯水提物(15g/kg)和四君子湯多糖(1.074g/kg)對β-catenin表達(dá)有提高作用(與模型組比較P0.05)。研究結(jié)論四君子湯(水提物和多糖)對吲哚美辛所致胃和小腸黏膜損傷有防治作用,可提高造模大鼠胃和小腸黏膜多胺(精脒)含量,提高胃和小腸黏膜緊密連接和粘附連接蛋白表達(dá),對腸通透性指標(biāo)增高和黏膜Ca~(2+)含量降低有改善作用,提示其防治胃腸黏膜損傷的作用可能與影響多胺和黏膜屏障有關(guān);多糖是四君子湯胃腸黏膜保護(hù)的有效組分之一。研究結(jié)果為探討益氣健脾方藥胃腸黏膜保護(hù)作用提供了參考。
【圖文】：

吲哚美辛 40mg/kg 組圖 2-1-1 吲哚美辛不同表 2-1-1 吲哚美辛不同劑正常組 吲哚美辛 10mg/kg 組 吲哚美辛 40mg/kg 組 2.2.1.3.2 吲哚美辛不同劑量對大鼠小如圖 2-1-2、表 2-1-2 所示，正常組大常；吲哚美辛 10mg/kg 組大鼠小腸腸管未評分較正常組高；吲哚美辛 40mg/kg 組大損傷，大體評分與正常組無明顯差異。

吲哚美辛 40mg/kg 組 吲哚美辛 40mg/kg 組圖 2-1-2 吲哚美辛不同劑量對大鼠小腸黏膜損傷圖表 2-1-2 吲哚美辛不同劑量對大鼠小腸黏膜損傷的評分n 評分正常組 2 0吲哚美辛 10mg/kg 組 5 4.80 1.30吲哚美辛 40mg/kg 組 5 0.40 0.552.2.1.4 討論本節(jié)以吲哚美辛（10mg/kg、40mg/kg）大鼠皮下注射造模，發(fā)現(xiàn)吲哚美辛（40mg/kg）能造成大鼠胃黏膜急性損傷，而對大鼠小腸未造成明顯損傷，，與本實驗室前期實驗結(jié)果相似[38]，胃黏膜損傷模型復(fù)制成功，40mg/kg 選為后續(xù)胃黏膜損傷實驗造模劑量；而吲哚美辛（10mg/kg）皮下注射則使大鼠小腸黏膜出現(xiàn)較明顯損傷，結(jié)合文獻(xiàn)報道[39]，較低劑量（如 10mg/kg）吲哚美辛皮下注射可能會引起大鼠小腸黏膜急性損傷，但本節(jié)實驗大鼠樣本量較少，待后續(xù)進(jìn)一步探討。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王濤;葛睿;楊飛;高建平;;黨參提取物對大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用[J];中藥藥理與臨床;2015年04期

2 趙世清;李茹柳;年立全;陶玉珠;曾丹;陳蔚文;;甘草對大鼠應(yīng)激性潰瘍及多胺影響的研究[J];中成藥;2015年03期

3 呂林;黃穗平;唐旭東;王靜;張海燕;康楠;張望;;四君子湯對脾虛證大鼠血清生長激素釋放肽及胃竇肥大細(xì)胞的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2015年02期

4 王晗;石莎;陳飛雪;李月月;曹靜;左秀麗;李延青;;共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在體評估NSAIDs相關(guān)胃病及其藥物干預(yù)效果[J];山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年08期

5 吳秀;周聯(lián);羅霞;鄧向亮;溫如燕;吳俊威;;四君子湯多糖對脾虛小鼠腸道菌群及免疫功能的影響[J];中藥藥理與臨床;2014年02期

6 車東升;潘麗;鐘榮珍;秦貴信;;閉合蛋白:結(jié)構(gòu)、功能及其相關(guān)調(diào)節(jié)機制[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2013年12期

7 周瑞祥;翁方中;戴偉;;嚴(yán)重?zé)齻笫竽c黏膜ZO-1mRNA表達(dá)的變化和細(xì)菌易位的研究[J];腸外與腸內(nèi)營養(yǎng);2013年05期

8 李茹柳;年立全;趙世清;溫鵬;隨晶晶;陶玉珠;陳蔚文;;黨參對應(yīng)激性潰瘍和細(xì)胞遷移及多胺的影響[J];廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2013年04期

9 王麗虹;羅霞;潘華新;周聯(lián);江益平;鄧向亮;;四君子湯總多糖對化療荷瘤小鼠腸黏膜和整體免疫損傷的保護(hù)作用[J];廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報;2012年06期

10 施甜;朱方石;徐婷婷;;脾虛與胃黏膜損傷相關(guān)性的理論探討[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2011年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 涂小華;四君子湯多糖對IEC-6細(xì)胞遷移多胺信號通路鈣離子調(diào)控影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

2 石莎;非甾體抗炎藥相關(guān)小腸黏膜損傷發(fā)生機制及藥物干預(yù)的實驗研究[D];山東大學(xué);2014年

3 趙盛云;四君子湯對脾虛證大鼠胃黏膜屏障功能影響的實驗研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學(xué);2014年

4 雷姍;生長抑素對腸上皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用及機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

5 張子理;益氣健脾中藥小腸隱窩干細(xì)胞分子藥理研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2002年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 伍婷婷;白術(shù)多糖通過多胺和Ca~(2+)調(diào)節(jié)IEC-6細(xì)胞遷移及粘附連接蛋白的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2017年

2 鄧嬌;四君子湯多糖分離解析及對IEC-6細(xì)胞遷移多胺信號通路的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

3 年立全;益氣健脾中藥提取物對大鼠應(yīng)激性潰瘍及多胺影響的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

4 陶玉珠;黨參和甘草提取物對IEC-6細(xì)胞遷移多胺調(diào)控信號通路作用的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2013年

5 王峰;D—乳酸與腸道屏障功能[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

本文編號：2603503